一种脾虚痰浊型高脂血症病证结合动物模型的制作方法
【专利摘要】一种脾虚痰浊型高脂血症病证结合动物模型的制作方法属于养殖脊椎动物的【技术领域】。该动物模型重复性和稳定性好，可适用于脾虚痰浊型高脂血症的基础研究以及中医健脾祛痰法治法治疗高脂血症的中药筛选。第一阶段、高脂饲料喂饲阶段：以配方8%花生油、1.5%胆固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黄粉、1%谷氨酸钠，以及78.1%基础饲料的高脂饲料，连续饲喂4周。第二阶段、饥饱失常及活动限制阶段：高脂饲料喂饲阶段后，单日饲喂上述高脂饲料不限量，及以1ml/100g猪油灌胃；双日饲喂干燥甘蓝压制的甘蓝条不限量；并单体置于尺寸为15×8×10cm的笼中饲养以减少活动，持续4周。即制成脾虚痰浊高脂血症病证结合动物模型。
【专利说明】一种脾虚痰浊型高脂血症病证结合动物模型的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于养殖脊椎动物的【技术领域】，具体地，是涉及一种用于脾虚痰浊型高脂血症的基础研究和中医健脾法治疗高脂血症中药筛选的实验动物模型建立方法。
【背景技术】
[0002]高脂血症也称血脂异常，是指由于脂质转运或代谢异常，使血浆中的总胆固醇(TC)、总甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、极低密度脂蛋白(VLDL-C)等致动脉粥样硬化脂质中的一种或多种水平高于正常，高密度脂蛋白(HDL-C)水平低于正常的一类代谢疾病。高脂血症是动脉粥样硬化的重要成因，也是导致心脑血管疾病的主要病理基础，其防治已在全球受到广泛关注，成为目前研究热点。随着人民生活水平的提高，高脂血症的发病率逐年攀升，严重危害着人类健康。
[0003]中医药在防治高脂血症方面具有明显特色和优势，在《中药新药临床研究指导原贝U》中将高脂血症的中医辨证分为:脾虚痰浊证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证、阴虚阳亢证和气滞血瘀证等。但在临床实践中发现，高脂血症尤以脾虚运化无力而致痰浊内停的脾虚痰浊证为多见。在临床治疗高脂血症时，将其归为中医学“痰瘀”范畴，认为脾失健运而生痰浊，痰以致瘀，痰瘀互结为高脂血症的主要病机。现代临床研究表明，人群脾虚痰浊型高脂血症的危险因素主要有三:第一、肥甘厚味，长期摄入高胆固醇、高甘油三酯食物，使得血脂水平升高，代谢失偿；第二、现代人生活不规律，常不能按时进餐，饥饿过后又过量饮食，使得脾气受损，运化无力，而致脂类堆积血脉；第三，大部分现代人生活压力大，体力劳动少，很少进行锻炼，机体气化无力 ，导致痰浊淤积，血脂升高。
[0004]西医高脂血症动物经典模型的制备方法通常是以高脂饲料饲喂动物。这种造模方法可使动物产生从血脂异常到动脉粥样硬化的一系列病变，可以模拟高脂血症的整个病变进程。高脂饲料饲喂所致高脂血症模型具有与临床相似度大、方法简单、模型重复性好、动物间个体差异小等特点，是目前高脂血症动物模型复制的主要方法。
[0005]在以往的关于健脾化痰法治疗高脂血症的中医和中西医结合实验研究中，也多延用上述单纯高脂饮食饲喂的方法，但是这种方法在中医证型方面无法加以控制，所制备高脂血症动物模型因动物自身体质因素形成了多种证型混杂。在基础研究中，无法客观的体现脾虚痰浊型高脂血症的基本致病因素和病理特征。对于普通高脂模型采用健脾化痰法治疗后，由于模型证型的不确定性，实验结果重复性和稳定性差，无法正确评价方药的确切疗效，对健脾化痰治法的各种方药疗效评价工作造成极大干扰。
[0006]过去的中医证候动物模型中，常综合膏粱厚味、劳倦过度、苦寒泻下、饥饱失常和寒湿困阻等方法来构成导致脾虚的要素，但经实践证明这些因素不能良好的反应临床的主要致病因素，所以探索一种方法上能够体现脾虚痰浊型高脂血症现代致病因素，结果上能够体现脾虚痰浊型高脂血症病理变化的模型是亟需解决的重要问题。
【发明内容】
[0007]本发明就是针对上述问题，弥补现有技术的不足，本发明提供了一种脾虚痰浊型高脂血症动物模型的制备方法，拟采用高脂饮食喂养复制高脂血症动物模型，并在此基础上结合饥饱失常脾虚证动物模型复制方法，并结合运动控制，建立一种符合高脂血症致病机理及病程进展，且与中医临床最为常见的中医辨证分型相似的病证结合的脾虚痰浊高脂血症动物模型。该动物模型重复性和稳定性好，可适用于脾虚痰浊型高脂血症的基础研究以及中医健脾祛痰法治法治疗高脂血症的中药筛选。
[0008]为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0009]第一阶段、高脂饲料喂饲阶段:
以配方8%花生油、1.5%胆固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黄粉、1%谷氨酸钠，以及78.1%基础饲料的高脂饲料，连续饲喂4周。
[0010]第二阶段、饥饱失常及活动限制阶段:
高脂饲料喂饲阶段后，单日饲喂上述高脂饲料不限量，及以lml/100g (动物体重)猪油灌胃；双日饲喂干燥甘蓝压制的甘蓝条不限量；并单体置于尺寸为15X8X IOcm(长X宽X高)的笼中饲养以减少活动，持续4周。
[0011]即制成脾虚痰浊高脂血症病证结合动物模型。
[0012]其中，基础饲料是大麦15%、小麦31%、玉米15%、麸皮15%、鱼粉6%，豆柏、油和盐共计 18%。
[0013]所述的动物是指270g± 30g的SPF级SD大鼠。
[0014]但在实际操作中`，如果直接饲喂甘蓝会遇到很多问题:1、甘蓝是一种易于腐烂的生鲜蔬菜，难以保存，需要实验人员现用现购，一方面加大了劳动量，另一方面每次购买甘蓝的数量较少，多次购买甘蓝品质可能会有差异，无法保证实验前后时期和各处理组之间的条件均一性。2、生鲜甘蓝难以消毒，现阶段大部分实验要求使用SPF级实验动物，而未经消毒的甘蓝无法带入SPF级实验室。3、生鲜甘蓝含水量大，在制作脾虚证动物模型时，作为动物模型的评价标准，常需统计动物进食量和进水量，喂食生鲜甘蓝会影响进水量的统计。
[0015]为了解决工作中遇到的上述困难，我们发明了一种用于饥饱失常饮食不节法致脾虚模型中使用的甘蓝条，这种经过了均质化、干燥处理的甘蓝条，能完美的解决上述问题。
[0016]所述的甘蓝条是经过以下方法制得:将甘蓝去除老叶，粗切后清洗，60_80°C烘干，粉碎过150目筛，加入占总质量5%淀粉糊(含淀粉20%)作为粘合剂，拌均后压制成直径1.5cm的条状，进行烘烤，炉温在200-220°C，烘烤10-15分钟，120°C高温、1.3Mpa高压消毒杀菌或福射消毒，I小时，最后冷却进行真空包装。
[0017]通过上述方法制得的甘蓝条，具有以下优势:1、经过清洗和消毒的甘蓝条无细菌、真菌及芽孢，符合SPF实验室要求，可以进行SPF级实验动物的饲喂。2、经过粉碎、均质的制作过程后，甘蓝条的质地均一，营养成分构成相同，排除了实验动物食用不同甘蓝部位造成的处理因素的差异。大批量生产的甘蓝条也排除了甘蓝购买批次不同，品种和状态不同所造成的营养含量不同，造成的各时段处理因素的差异。3、经过了烘干的甘蓝条可在实验中控制其水分全部由饮水摄入，可以更好的统计动物每日摄食量和饮水量。
[0018]与现有技术相比本发明的有益效果。
[0019](I)采用长期饲喂高脂饲料造成血脂异常，并在血脂异常的基础上发生肝细胞脂肪堆积，动脉粥样硬化，从而复制出高脂血症特有病变。[0020](2)对于所用的高脂饲料的组成及配比进行了改进，并排除了经典高脂配方饲料中所用的胆盐。因在实践中发现，胆盐入肝经胆经，大寒大苦；在配方中加入胆盐使得肝胆经亦有病变，影响动物成模。
[0021](3)根据中医理论复制脾虚痰浊大鼠模型，具有痰浊困脾证候，如毛发油腻发黄、食欲低下、便溏、体重增长缓慢等表现。
[0022](4)大鼠放置在小笼中饲养，在使其运动量减少的同时，因并未加以束缚，不会造成大鼠情志障碍，使造模分型准确。
[0023](5)使用干燥甘蓝制成的甘蓝条，可进行SPF级实验动物造模。
[0024](6)与现有技术相比，本发明所构建的动物模型与脾虚型高血脂症临床病变症状、体征相似，并经过重复建模，证明其重复性和稳定性良好，适用于中医健脾祛痰法治疗高脂血症的中药筛选，可为开展相关的新药研发提供实验依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1-1和图1-2是实验I的大鼠油红染色结果对比图(400X);其中，图1_1为正常组，图1_2为脾虚闻脂血症组。
[0026]图2-1、图2-2和图2-3是实验2的大鼠油红染色结果对比图(400X );其中，图
2-1为正常组，图2-2为高脂血症组，图2-3为脾虚高脂血症组。
【具体实施方式】
[0027]实验I。
[0028]实验材料:①动物:雄性SD大鼠，SPF级，体重270g±30g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2012-0001。动物购进后，饲养环境温度为(25土 I) °C，自然光照，喂以正常饲料自由饮食，适应环境7天，进入实验过程。随机分为正常组和脾虚痰浊高脂血症组。
[0029]②主要试剂:TC测定试剂盒(批号:0113011), TG测定试剂盒(批号:0113011),LDL-C测定试剂盒(批号:0113011)、HDL-C测定试剂盒(批号:0113011)、AMY测定试剂盒(批号:0113011)，均购自于四川迈新生物技术有限公司。D-木糖试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。
[0030]③主要仪器:iMark型酶标仪,Trans-BlotSD 半干转印(Bio-Rad) ;Mx300P 型 RealTime PCR仪(Agilent)，荧光显微镜(Leica);全自动生化分析仪(日本东芝)。
[0031]脾虚高脂血症组以配方为8%花生油、1.5%胆固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黄粉、1%谷氨酸钠，以及78.1%基础饲料的高脂饲料，饲喂4周。而后单日饲喂上述高脂饲料不限量，并以lml/100g猪油灌胃；双日饲喂干燥甘蓝压制的蔬菜饼不限量，大鼠单只小笼(15 X 8 X IOcm)饲养以减少活动，持续4周。
[0032]实验方法:(1)一般体征评分。根据下表中各项，对于实验动物逐一评分。评分采用随机盲评法,实验人员由A、B、C三个小组组成。A小组成员由本实验的人员组成,负责捉取实验鼠，具体操作为抛硬币决定实验鼠所属组别，并按照实验鼠编号由小至大逐一捉入小笼，交给未看到此过程的B小组成员并记录组别、实验鼠编号和顺序号。B小组成员由不清楚本实验内容的人员构成，负责将实验鼠呈现给C小组成员并报告顺序号。C小组成员由不清楚本实验内容，但有一定的动物实验经验的人员组成，负责按照下述评分表逐一进行打分，并按顺序号记录。评分全部结束后，由本实验小组成员按照A小组成员的记录统计各组评分。
【权利要求】
1.一种脾虚痰浊型高脂血症病证结合动物模型的制作方法，其特征在于: 第一阶段、高脂饲料喂饲阶段: 以配方8%花生油、1.5%胆固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黄粉、1%谷氨酸钠，以及78.1%基础饲料的高脂饲料，连续饲喂4周； 第二阶段、饥饱失常及活动限制阶段: 高脂饲料喂饲阶段后，单日饲喂上述高脂饲料不限量，及以lml/100g (动物体重)猪油灌胃；双日饲喂干燥甘蓝压制的甘蓝条不限量；并单体置于尺寸为15X8X10 (长X宽X闻)的笼中词养以减少活动，持续4周； 即制成动物模型。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于:其制得的动物模型用于脾虚痰浊型闻脂血症的基础研究以及中医健脾怯疲法治法治疗闻脂血症的中药筛选。
3.权利要求1所述的甘蓝条的制作方法，其特征在于:将甘蓝去除老叶，粗切后清洗，60-80°C烘干，粉碎过150目筛，加入占总质量5%淀粉糊(含淀粉20%)作为粘合剂，拌均后压制成直径1.5cm的条状，进行烘烤，炉温在200-220°C，烘烤10-15分钟，120°C高温、1.3Mpa高压消毒杀菌或辐射消毒，I小时，最后冷却进行真空包装。
4.权利要求1所述的脾虚痰浊型高脂血症病证结合动物模型的检测方法，其特征在于: 实验材料:①动物:雄性SD大鼠，SPF级，体重270g±30g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2012-0001 ;动物购进后，饲养环境温度为(25 土 I)V,自然光照，喂以正常饲料自由饮食，适应环境7天，进入实验过程，随机分为正常组和脾虚痰浊高脂血症组； ②主要试剂:TC测定试剂盒(批号:0113011)、TG测定试剂盒(批号:0113011)、LDL-C测定试剂盒(批号:0113011)、HDL-C测定试剂盒(批号:0113011)、AMY测定试剂盒(批号:0113011)，均购自于四川迈新生物技术有限公司；D-木糖试剂盒，购自南京建成生物工程研究所； ③主要仪器:iMark型酶标仪，Trans-BlotSD半干转印(Bio-Rad) ;Mx300P型RealTime PCR仪(Agilent)，荧光显微镜(Leica);全自动生化分析仪(日本东芝)； 脾虚高脂血症组以配方为8%花生油、1.5%胆固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黄粉、1%谷氣酸纳，以及78.1%基础词料的闻脂词料，词喂4周；而后单日词喂上述闻脂词料不限量，并以lml/100g猪油灌胃；双日饲喂干燥甘蓝压制的蔬菜饼不限量，大鼠单只小笼(15X8X IOcm)饲养以减少活动，持续4周； 实验方法:(1) 一般体征评分；根据下表中各项，对于实验动物逐一评分，评分采用随机盲评法，实验人员由A、B、C三个小组组成，A小组成员由本实验的人员组成,负责捉取实验鼠，具体操作为抛硬币决定实验鼠所属组别，并按照实验鼠编号由小至大逐一捉入小笼，交给未看到此过程的B小组成员并记录组别、实验鼠编号和顺序号，B小组成员由不清楚本实验内容的人员构成，负责将实验鼠呈现给C小组成员并报告顺序号，C小组成员由不清楚本实验内容，但有一定的动物实验经验的人员组成，负责按照下述评分表逐一进行打分，并按顺序号记录，评分全部结束后，由本实验小组成员按照A小组成员的记录统计各组评分； (2)D-木糖排泄率；大鼠禁食不禁水12小时，3%D-木糖溶液每只4ml灌胃，置于代谢笼中，禁食不禁水，收集5小时尿液，称量总尿量，并每例取0.5ml尿液样本，对溴苯胺法测量尿液中D-木糖含量，并计算D-木糖排泄率； (3)TG、TC、LDL-C、HDL-C、α -淀粉酶；大鼠水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，室温静置30分钟，2000rpm离心20分，取血清，Toshiba全自动血液分析仪测定TG、TC、LDL-C, HDL-C,α-淀粉酶； (4)肝脏油红O染色；肝脏样本制备冰冻切片(6μ m),切片干燥后入50%乙醇水洗，油红O染色8min，50%乙醇分化，自来水终止分化，苏木素复染，自来水反蓝，甘油明胶封片；光学显微镜下观察各组大鼠肝组 织脂质沉积情况。
【文档编号】A01K67/02GK103749385SQ201410024236
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】杨关林, 贾连群, 李宁, 张立德, 张会永, 陈阳, 朱美林, 冷雪, 杜莹 申请人:辽宁中医药大学