斜带石斑鱼抗菌肽leap-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用。石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者是SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。本发明还首次获得了石斑鱼抗菌肽LEAP-2的基因序列以及经密码改造后的LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2的核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、抗菌制剂、鱼类免疫制剂或饲料添加剂，为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础。
【专利说明】斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种抗菌肽LEAP-2前体蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用；还涉及一种LEAP-2成熟肽蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用。
【背景技术】
[0002]抗菌肽是生物体内产生的一种具有生物活性的天然小分子多肽，在多种生物体中广泛存在，是生物体免疫系统的一个重要组成部分。自从Steiner于1981年首次在昆虫体内发现抗菌肽的存在以后，到目前为止人们已经在多个物种中发现了上千种抗菌肽。同时，人们也发现了抗菌肽可以作用于G+和G一细菌、真菌、寄生虫甚至病毒，并且不会对正常细胞产生危害以及产生耐药性。
[0003]LEAP-2 全称为肝脏表达的抗菌妝-2 (liver-expressed antimicrobialpeptides-2),属于抗菌肽的一种。它是2003年Krause等在人类血液中首次发现的。LEAP-2最初在肝脏中以前体的形式合成，之后被转运到血液中。在此过程中，LEAP-2被修饰和加工形成成熟肽，主要涉及信号肽的切除和二硫键的形成。LEAP-2前体蛋白一般包括100个氨基酸左右，成熟肽一般包括约40个氨基酸。LEAP-2的蛋白结构与其它抗菌肽蛋白结构存在很大不同，其最主要的特点是多肽序列中包含四个半胱氨酸，并且这四个半胱氨酸可以以1-3、2-4的形式形成两个二硫键。再通过氢键的作用，LEAP-2成熟肽最终可以形成β折叠等高级结构。另外，研究发现LEAP-2具有与一般抗菌肽相同的广谱抑菌能力。
[0004]石斑鱼类隶属S卢形目iPerciformes),鯧科{Serranidae),石斑鱼亚科(Bpinephelinae),石斑鱼属(Bpinephelus),为暖水性礁栖鱼类,广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域。石`斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类之一，其肉质鲜美，营养丰富，为餐桌中的上等佳肴，被港澳地区推为我国的四大名鱼之一，深受各地消费者的喜爱，经济价值巨大。但是，当前气候灾害和环境污染导致的高致病率和高死亡率，一直是石斑鱼人工养殖过程中难以解决的问题。市场上还没有一种能够有效增强石斑鱼免疫力或不产生耐药性的饲料添加剂。
[0005]酵母是最简单的真核生物，以其作为宿主表达外源蛋白有很大的优势:生长繁殖快，易培养，操作简单；能对表达的外源蛋白进行翻译后加工修饰，如糖基化、乙酰化等；安全性高，无致病性。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能将甲醇作为代谢的唯一碳源和能源。毕赤酵母表达系统有很多优点在科研及生产中广泛应用:使用强的可诱导启动子-AOXl基因启动子；外源基因以单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定性好；重组蛋白以高水平分泌到几乎无蛋白的培养基中，利用表达蛋白的纯化；容易进行高密度发酵，适合于产业化生产。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的在于提供一种石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白。
[0007]本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白的基因。
[0008]本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白。
[0009]本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的野生型基因以及经密码子偏好性改造后的基因mLEAP-2。
[0010]本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白基因或LEAP-2成熟妝蛋白基因的克隆载体或表达载体。
[0011]本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组前体蛋白及其制备方法。
[0012]本发明的另一目的在于提供石斑鱼LEAP-2前体蛋白和/或LEAP-2成熟肽蛋白的应用。
[0013]本发明所采取的技术方案是:
石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或者是SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。
[0014]编码石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白的基因，其含有SEQ ID N0.1第262-561 bp所示的核苷酸序列。
[0015]石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是SEQID N0.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。
[0016]编码石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的基因，其为SEQ ID N0.1第421-561 bp所示的核苷酸序列，或者是SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
[0017]携带有石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白基因或/和抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白基因的载体。
[0018]含有石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白基因或/和抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白基因的重组菌株。
[0019]生产石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白或石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的方法，包括将携带有抗菌肽LEAP-2前体蛋白基因或抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白基因的表达载体导入宿主细胞中，表达得到LEAP-2前体蛋白或LEAP-2成熟肽蛋白。
[0020]石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白或/和抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白在制备抗菌制剂中的应用。
[0021]石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白或/和抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白在制备提高水产动物免疫力制剂中的应用。
[0022]本发明的有益效果如下:
1.本发明首次获得了石斑鱼的抗菌肽LEAP-2基因序列以及LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂或饲料添加剂， 为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础；
2.将石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因核苷酸序列和mLEAP-2基因序列在毕赤酵母重组株表达，可以大量生产石斑鱼LEAP-2重组蛋白和mLEAP-2抗菌肽段，大大降低了生产成本，具有很高的经济价值；
3.本发明所提供的石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组蛋白和mLEAP-2抗菌肽，经抑菌实验证明具有较强的抑菌能力，可以用于制备抗菌制剂替代传统抗生素或者应用于制备鱼类尤其是石斑鱼免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用前景。
[0023]【专利附图】
【附图说明】
图1是斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因中间片段合成产物的琼脂糖凝胶电泳分析图； 图2是斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因5’端片段合成产物的琼脂糖凝胶电泳分析图； 图3是斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因3’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图； 图4是LEAP-2基因全长鉴定的PCR扩增产物的电泳鉴定图；
图5是经密码子偏好性改造后的斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2第二轮PCR扩增产物的凝胶电泳分析图；
图6是克隆载体pMD18-T-mLEAP-2双酶切、孙aJ)验证图；
图7是表达载体pPICZ a A-mLEAP-2双酶切(McoR1、XbaD验证图；
图8是斜带石斑鱼带限制性酶切位点(McoR1、XbaI)的LEAP-2基因合成产物的电泳鉴定图；
图9是克隆载体pMD18-T-LEAP-2双酶切iEcoRI ,XbaI)验证图；
图10是表达载体pPICZ a A-LEAP-2双酶切(McoR1、XbaD验证图；
图11是重组株pPICZ a A-LEAP-2-X-33表达产物LEAP-2重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图；
图12是重组株pPICZaA-LEAP-2-X-33表达产物LEAP-2重组蛋白的western-blot鉴定图；
图13是pPICZ a A-LEAP-2毕赤酵母表达载体构建示意图；
图14是斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2信号肽预测结果；
图15是石斑鱼抗菌肽LEAP-2的氨基酸序列和其它鱼类LEAP-2氨基酸序列的对比图； 图16是mLEAP-2抗原表位预测分析；
图17是石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组蛋白对溶藻弧菌抑菌实验结果；
图18是石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组蛋白对维氏气单胞菌抑菌实验结果；
图19是石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组蛋白对大肠杆菌抑菌实验结果；
图20是重组株pPICZ a A-mLEAP-2-X-33表达产物mLEAP-2重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图；
图21是斜带石斑鱼抗菌肽mLEAP-2对溶藻弧菌抑菌实验结果。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
[0025]一、通过设计简并引物扩增获得斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因中间片段 首先在NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上查找斑马鱼、大黄鱼、罗非鱼、
牙鲆、虹鳟鱼抗菌肽LEAP-2基因序列(序列号分别为:NM_001128777.1、JN991058.1、XM_003457723.UEU586111.UAY362186.1)，然后用 ClustalX 2.0 进行序列比对。根据比对结果设计简并引物，其中上游引物LEAP-2-S为【5’- TTCACCCAAAGGAAAGCAGC] (SEQ IDN0.6)，下游引物 LEAP-2-A 为【5’- GTCCCGTGGAGCATTCGTAG】(SEQ ID N0.7)。最后使用广州东盛生物科技有限公司 PCR Mix 以 M-MLV reverse transcriptase kit (Invitrogen,USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板扩增得到斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因中间片段，其中间片段长度为220bp (SEQ ID N0.5)。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图1，其中:M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。
[0026]二、斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因5’端片段的合成
操作按照 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech, CA,USA) Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的石斑鱼抗菌肽LEAP-2中间片段的序列设计了一条下游基因特异性引物进行5’ RACE扩增。该基因特异性引物LEAP2G-A的序列为【5’ - CATCCGAGCGACCCTCTTCAGTGTG】(SEQ ID N0.9)。
[0027]扩增过程以使用BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD BioscienceClontech, CA，USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA第一条链为模板，经TaKaRa TaqHot Start Version (TaKaRa Biotechnology, Japan)方法扩增石斑鱼抗菌妝 LEAP-2 中间片段序列第144位至5’端的核苷酸序列。其中反应条件为:(1)94°C变性30秒，72°C延伸3分钟，共5循环；(2)94°C变性30秒，70°C退火30秒，72°C延伸3分钟，共5循环；(3)94°C变性30秒，68 °C退火30秒，72 °C延伸2分钟，共25循环；最后72°C延伸5分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2，其中:M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。
[0028]将423bp的扩增产物连接到pMD18-T载体上得到重组质粒pMD18-T_LEAP2_5’。将重组质粒PMD18-T-LE AP2-5’用pMD18_T的一对通用引物进行序列测定，其序列如SEQ IDN0.8所示。测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆得到的423bp产物是斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因5’端序列。
[0029]三、斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因3’端片段的合成
操作按 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech, CA,USA) Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的石斑鱼抗菌肽LEAP-2中间片段的序列设计了两条上游引物LEAP2G-S1和LEAP2G-S2以进行巢式PCR扩增。第一条上游引物 LEAP2G-S1 为【5’ - CTGGC TCAGCAGGTGTGTGCGGGTC】(SEQ ID N0.11)，第二条上游引物LEAP2G-S2 为【5，- CACACTGAAGAGGGTCGCTCGGATG】(SEQ ID N0.12)。
[0030]第一次PCR 以 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD BioscienceClontech, CA，USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA第一条链为模板，引物为LEAP2G-SI,经touchdown PCR方法扩增抗菌肽LEAP-2中间片段的序列第67位至3’poly A端的核苷酸序列。其中反应条件为:94°C预变性3分钟；(1)94°C变性30秒，70°C (每增加一个循环退火温度减少1°C)退火30秒，72°C延伸2分钟，共15循环；(2)94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分钟，共15循环；最后72°C延伸5分钟。第二次PCR以第一次PCR产物稀释5倍以后的产物为模板，经touchdown PCR方法扩增抗菌肽LEAP-2中间片段的序列第120位至3’ poly A端的核苷酸序列。其中反应条件为:94°C预变性3分钟；(I)94°C变性30秒，700C (每增加一个循环退火温度减少1°C )退火30秒，72°C延伸2分钟，共15循环；(2) 94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分钟，共15循环；最后72°C延伸5分钟。第一次PCR在琼脂糖凝胶上未能检测出条带，第二次PCR扩增产物的电泳鉴定图见图3，其中:M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。
[0031]将471bp的扩增产物连接到pMD18-T载体上得到重组质粒pMD18_T-LEAP2_3’。将重组质粒PMD18-T-LEAP2-3’用pMD18_T的一对通用引物进行序列测定，其序列如SEQ IDN0.10所示。测序结果与Genebank的序列进行比较,结果表明克隆的471bp产物是斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因的3’端序列。
[0032]四、斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因全长序列的拼接
将已经测序的石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因中间片段、5’ RACE片段和3’ RACE片段进行拼接，得到全长为869bp的斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因cDNA全序列(SEQ ID N0.1)。其ORF全长，即斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2 cDNA全序列(SEQ ID N0.1)的第262— 561bp，总长为300bp，并推测出其氨基酸序列(SEQ ID N0.2)。
[0033]根据拼接得到的LEAP-2基因ORF全长设计引物LEAP2FL-S[5’ -TGGTAGAGTCCTCCAGTAAGTGT] ( SEQ ID N0.I 3)，LEAP 2FL-A【5，-GCATAATCCCAGTAATGACAACC】(SEQ ID N0.14)。反应以 M-MLV reverse transcriptasekit (Invitrogen, USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板,经touchdown PCR方法扩增石斑鱼的抗菌肽LEAP-2 ORF全长序列，扩增的产物长度为440bp。PCR反应条件为:(I) 94°C预变性3分钟；(2) 94°C变性30秒，55°C (每增加一个循环退火温度下降1°C )退火30秒，72°C延伸2分钟，共15个循环；(3)94°C变性30秒，43°C退火30秒，72°C延伸2分钟，共15个循环；最后72°C延伸5分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图4，其中:M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。PCR产物送去华大基因公司测序，测序结果和拼接结果一致。
[0034]五、生物信息学方法分析斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽序列` 经文献调研和NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)网站搜索,得到了大黄鱼、罗非鱼和牙鲆LEAP-2成熟肽的氨基酸序列。然后使用SignalP 4.0 ServerChttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线预测斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2信号肽序列(图14)。再使用clustalx和GeneDoc两个序列分析软件，将大黄鱼、罗非鱼和牙鲆LEAP-2成熟肽的氨基酸和斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2氨基酸序列进行序列比对，预测得到斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽的氨基酸序列(图15) JBSEQ ID N0.4所示。另外，通过DNAstar软件分析斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因的抗原表位(图16)，进一步确定包含最多结合位点的斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2的成熟肽基因序列(LEAP-2 ORF的第160bp_300bp，共141bp)。最后，使用RNAstructure 5.3软件分析了该功能片段的RNA 二级机构,发现没有复杂的二级结构。
[0035]六、斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2的密码子偏好性改造
通过分析比较斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽cDNA原序列和毕赤酵母表达偏好密码子表，发现斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽cDNA原序列中存在毕赤酵母低效表达的稀有密码子。故我们在不改变LEAP-2成熟肽氨基酸序列的基础上设计了 4条改造引物PU P2、P3、P4并使用引物搭桥法修改了 29个密码子，共35个核苷酸，得到修改后的LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2序列141bp (SEQ ID N0.3)，加上保护碱基、及^7? I和油a J酶切识别位点、终止密码子及6Xhis标签共176bp (如图5)。其中引物Pl含有保护碱基和I限制性酶切识别位点，引物P4含有保护碱基、Xba I酶切识别位点、终止密码子及6Xhis标签。四条引物序列分别为:P1【5’ -GCTGAATTCATGACCCCATTGTGGAGAAT CATGAACTCCAAGCCATTCGGTGCTTACTG】(SEQ ID N0.15)、P2【5’ -GCTC TACACAAACCGGTGGAACACTCGTAGTTGTTTTGACAGTAAGCACCGAAG GCTTG】(SEQ ID N0.16), P3【5’ -TTCCACCGGTTTGTGTAGAGCTG GTCACTGTTCCACCTCCCAAAGATCCTTGTCCGAGCC] (SEQ IDN0.17), P4【5’ -GCTCTAGACTAATGATGATGATGATGATGGTAGTTGACTGGCTCGG ACAAGGATCTTTGG】(SEQ ID N0.18)。第一轮反应将引物P2与P3混合，加入广州东盛生物科技有限公司的PCRMix,得到约99bp的PCR产物，与预期产物大小相符。反应按照如下条件进行:94°C预变性3分钟；(I) 94°C变性30秒，64°C (每增加一个循环退火温度减少TC )退火30秒，72°C延伸I分钟，共15循环；(2)94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸I分钟，共15循环;最后72°C延伸5分钟。将第一轮PCR产物稀释5倍后作为模板，以Pl和P4为引物进行第二轮扩增，结果得到约176bp的条带，与预期大小相符。反应条件为:94°C预变性3分钟；(I)94°C变性30秒，64°C (每增加一个循环退火温度减少1°C )退火30秒，72°C延伸I分钟，共15循环；(2)94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸I分钟，共15循环；最后72°C延伸5分钟。琼脂糖电泳结果见图5，其中:M为分子量标准；NC为阴性对照；I为PCR扩增产物。
[0036]七、含斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2序列的克隆载体
将步骤六所获得目的基因片段分离纯化，然后与PMD18-T (TAKARA)载体按照该试剂盒提供的体系4°C连接过夜(约16h)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，经Amp+抗性和蓝白斑筛选出阳性克隆，通过质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经过双酶切验证以及测序验证，证明斜带石斑鱼LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2克隆到载体中，命名为pMD18-T-mLEAP_2，克隆载体转化大肠杆菌DH5a所得到的重组菌株命名为pMD18-T- mLEAP-2_DH5 a。使用及、XbaI对克隆载体pMD18-T- mLEAP-2进行双酶切，酶切图谱见图6，其中M: marker, NC为PMD18-T- mLEAP-2,1:pMD18_T- mLEAP-2 的、XbaI 双酶切产物。
[0037]八、含斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2序列的表达载体pPICZ a A-mLEAP-2的构建
克隆载体PMD18-T- mLEAP-2用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收。回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化得到176bp的斜带石斑鱼成熟肽基因mLEAP-2序列；
载体质粒PPICZ a A经限制性内切酶EcoRI和油a/双酶切后分离纯化3.6kb的大片段，与约176bp的斜带石斑鱼LEAP-2成熟肽mLEAP-2基因片段按1:3混合，用T4连接酶16°C连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用低盐LB平板筛选具Zeocin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约3.Skb的重组质粒，用限制性内切酶双酶切重组质粒，得到约176bp和3.6kb的两个片段，大小分别与斜带石斑鱼LEAP-2成熟肽mLEAP-2的基因片段和表达载体pPICZ a A大小相同，证明斜带石斑鱼LEAP-2成熟肽mLEAP-2的基因片段已克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ a A中，重组质粒命名为pPICZ a A- mLEAP-2 ο质粒构建流程图见图13。使用、油a J对表达载体pPICZ a A-mLEAP-2进行双酶切，酶切分析图见图7，其中M: marker, I:pPICZ a A- mLEAP-2双酶切产物，NC为pPICZ a A双酶切产物。
[0038]九、能高效表达斜带石斑鱼抗菌肽mLEAP-2的毕赤酵母重组株pPICZ a A- mLEAP-2-X-33的构建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect? Pichia Expression Kit 说明书制备毕赤酵母X-33感受态细胞，重组质粒pPICZ a A- mLEAP-2用SacI线形化后凝胶回收，用标准方法电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，在含Zeocin 400 μ g/ml的YPDS平板上28°C恒温培养。约3d后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达斜带石斑鱼抗菌肽mLEAP-2的毕赤酵母重组株pPICZ a AiLEAP-2 _X_33。
[0039]十、利用毕赤酵母基因工程菌pPICZ a A- mLEAP-2 _X_33生产重组斜带石斑鱼抗菌肽 mLEAP-2
分别挑取各种工程菌的单克隆，接种于BMGY中，28°C，200rpm培养0D600至2_6，换BMMY培养基稀释0D600至1.0，每24h向培养基中补加0.5%甲醇，培养24h_96h后2000rpm，4°C收集上清。取Iml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加5X电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pPICZ a A转化X-33后长出的单克隆培养后的上清蛋白。结果见图20，其中:Μ:蛋白分子量标准；NC为阴性对照；1为重组酵母菌株pPICZ a A- mLEAP-2-X_33分别诱导96h后的表达产物。结果显示与阴性对照相比，重组菌株pPICZ a A- mLEAP-2-X-33表达产物在IOKDa附近出现一条新的蛋白条带。
[0040]十一、斜带石斑鱼抗菌肽mLEAP-2抗原活性鉴定实验
将重组斜带石斑鱼抗菌肽mLEAP-2采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠源6xhis标签单克隆抗体(Novagen), 二抗为羊抗鼠IgG-HRP (鼎国公司)。结果显示6xhis标签 单克隆抗体能识别毕赤酵母表达的重组斜带石斑鱼抗菌肽mLEAP-2，与Tricine-SDS-PAGE结果一致，证明得到的蛋白即为斜带石斑鱼抗菌肽mLEAP-2。
[0041 ] 十二、斜带石斑鱼带限制性酶切位点的抗菌肽LEAP-2基因ORF序列的合成
根据拼接得到的斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2的cDNA序列(SEQ ID N0.1),设计合成两段引物:上游引物是在该片段第I位至第25位碱基前加上保护碱基和feoTPJ的限制性内切酶识别位点【5’- GCTGAATTCATGCAGGAGACAGGCTACTTCACCC] (SEQ ID N0.19)，共 34bp ;下游引物是在该片段互补链的第4位至第19位碱基前加上油a/的酶切识别位点、保护碱基、6Xhis 标签和终止密码子【5’- GCTCTAGCTAATGATGATGATGATGATGGTAGTTCACAGGCTCT】(SEQID N0.2O),共 45bp。以 M-MLV reverse transcriptase kit (Invitrogen,USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经PCR方法扩增得到斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因的ORF序列，PCR反应条件为:94°C预变性3分钟；(1)94°C变性30秒，63°C (每增加一个循环退火温度减少1°C )退火30秒，72 °C延伸I分钟，共15循环；(2 ) 94 V变性30秒，49 V退火30秒，72°C延伸I分钟，共15循环；最后72°C延伸5分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图8，其中:M: marker, I为PCR扩增产物，NC为阴性对照。从图8可见PCR扩增产物大小约为335bp。
[0042]十三、含斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因序列的克隆载体
将步骤九所获得目的基因片段分离纯化，然后与PMD18-T (TAKARA)载体按照该试剂盒提供的体系4°C连接过夜(约16h)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，经Amp+抗性和蓝白斑筛选出阳性克隆，通过质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经过双酶切验证以及测序验证，证明斜带石斑鱼LEAP-2前体蛋白基因ORF序列克隆到载体中，命名为pMD18-T-LEAP_2，克隆载体转化大肠杆菌DH5 α所得到的重组菌株命名为pMD18-T-LEAP-2-DH5 α。使用EcoR1、ZhJ对克隆载体pMD18-T-LEAP-2进行双酶切，酶切图谱见图9，其中M: marker, NC为PMD18-T-LEAP-2,1:pMD18-T-LEAP_2 的、XbaI 双酶切产物。
[0043]十四、含斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因序列的表达载体pPICZa A-LEAP-2的构建 克隆载体PMD18-T-LEAP-2用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切后，酶切产物用
E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收,进行琼脂糖凝胶电泳,分离纯化得到335bp的斜带石斑鱼LEAP-2前体蛋白ORF基因序列；
载体质粒pPICZ a A经限制性内切酶及和油a/双酶切后分离纯化3.6kb的大片段，与约335bp的斜带石斑鱼LEAP-2前体蛋白ORF基因片段按1:3混合，用T4连接酶16°C连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5 α中，用低盐LB平板筛选具Zeocin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约4.0 kb的重组质粒，用限制性内切酶和ZhJ双酶切重组质粒，得到335bp和3.6kb的两个片段，大小分别与斜带石斑鱼LEAP-2前体蛋白ORF基因片段和表达载体pPICZ a A大小相同，证明斜带石斑鱼LEAP-2前体蛋白ORF基因片段已克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ a A中，重组质粒命名为pPICZ a A- LEAP-2。质粒构建流程图见图13。使用、油aJ对表达载体pPICZ a A- LEAP-2进行双酶切，酶切分析图见图10，其中M: marker, I:pPICZ a A- LEAP-2双酶切产物，NC:pPICZ α A双酶切产物。
[0044]十五、能高效表达斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白的毕赤酵母重组株pPICZ a A- LEAP-2 -X-33 构建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect? Pichia Expression Kit 说明书制备毕赤酵母X-33感受态细胞，重组质粒pPICZ a A- LEAP-2用SacI线形化后凝胶回收，用标准方法电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，在含Zeocin 400 μ g/ml的YPDS平板上28°C恒温培养。约3d后长出单克隆，挑取单克隆经诱`导培养与鉴定筛选出能高效表达斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组蛋白的毕赤酵母重组株pPICZ a A-LEAP-2 -X-33。
[0045]十六、利用毕赤酵母基因工程菌pPICZ a A_ LEAP_2 _X_33生产重组斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白
分别挑取各种工程菌的单克隆，接种于BMGY中，28°C，200rpm培养0D600至2_6，换BMMY培养基稀释0D600至1.0，每24h向培养基中补加0.5%甲醇，培养24h_96h后2000rpm，4°C收集上清。取Iml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加5X电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑TriCine-SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒PPICZaA转化X-33后长出的单克隆培养后的上清蛋白。结果见图11，其中:M:蛋白分子量标准；NC为阴性对照；1、2、3、4:重组酵母菌株pPICZ a A-LEAP-2-X-33分别诱导24h、48h、72h、96h后的表达产物。结果显示与阴性对照相比，重组菌株pPICZ a A- LEAP-2 -X-33表达产物在12KDa附近出现一条新的蛋白条带，并且诱导48h后菌株的表达量最闻。
[0046]十七、斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白抗原活性鉴定实验
将重组斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠源6xhis标签单克隆抗体(Novagen), 二抗为羊抗鼠IgG-HRP (鼎国公司)。结果见图12，其中:M:蛋白分子量标准；NC为阴性对照；1、2、3、4:重组酵母菌株pPICZ a A- LEAP-2 _X_33表达产物Western blot鉴定图谱。结果显示6xhis标签单克隆抗体能识别毕赤酵母表达的重组斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白，与Tricine-SDS-PAGE结果一致，证明得到的蛋白即为斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组前体蛋白。
[0047]十八、斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组前体蛋白抗菌活性检测实验
实验主要采用Kirby-Bauer法(即K-B纸片琼脂扩散法)检测斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组前体蛋白抗菌活性。供检测的细菌共3种，即溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus'y^2'^，由中国科学院南海海洋研究所惠赠；维氏气单胞菌(Vickers aeromonas bacillus) B565,由广东省水产健康安全养殖重点实验室保藏；大肠杆菌DH5a，购买于广东省微生物菌种保藏中心；三种均为革兰氏阴性细菌。首先分别配制LB固体培养基(tryptone 10g, NaCl10g, yeast extract 5g, Agar 15g,加 H2O 至 1000ml,调节 ρΗ=7.2)、TCBS 固体培养基(酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g,硫代硫酸钠10.0g,枸橼酸钠10.0g,牛胆粉5.0g,牛胆酸钠3.0g,蔗糖20.0g,氯化钠10.0g,柠檬酸铁1.0g,麝香草酚兰0.04g,琼脂15.0g,加水至1L，pH=8.6土 0.1)和人工海水固体培养基(酵母粉lg，牛肉膏3g，胰蛋白胨5g，琼脂糖15g，加15%。海水至1L)备用。然后取10 μ I大肠杆菌原菌液加入到20ml LB培养基(tryptone IOg7NaCl10g, yeast extract 5g,加H2O至1000ml,调节pH=7.2)、取10 μ I溶藻弧菌和维氏气单胞菌原菌液加入到20ml人工海水培养基(酵母粉lg，牛肉膏3g，胰蛋白胨5g，加15%。海水至1L)中活化，使其0D600值分别达到0.5-1.0。将转入pPICZ a A的酵母菌液(即空载)和已诱导表达的pPICZ a A- LEAP-2 _X_33重组毕赤酵母菌液于4°C，1000Orpm离心5min，得上清备用。取100 μ I上清和100 μ I Ampicillin (0.005 μ g/ μ L)溶液分别加到直径均为5mm、已灭菌的滤纸片上,室温放置30min至滤纸片重新干燥。取50 μ I活化的大肠杆菌、溶藻弧菌和维氏气单胞菌菌液分别加到LB、TCBS和人工海水固体培养基上，均匀涂布。将加有上清和Ampicillin的滤纸片放置到涂有菌液的培养基上，每板共放置5个滤纸片。最后将大肠杆菌平板放置于37°C的培养箱中,将溶藻弧菌、维氏气单胞菌放置在28°C的培养箱中，培养24h后观察抑菌圈的大小。图17显示的是石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组蛋白对溶藻弧菌抑菌实验结果:1为加有Ampicillin的滤`纸片，2为加有转入pPICZ a A的酵母菌液上清的滤纸片，3为加有已诱导表达的pPICZ a A- LEAP-2 -X-33重组毕赤酵母菌液上清的滤纸片。图18显示的是石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组蛋白对维氏气单胞杆菌抑菌实验结果:1为加有Ampicillin的滤纸片，2为加有转入pPICZ a A的酵母菌液上清的滤纸片，3为加有已诱导表达的pPICZ a A- LEAP-2 _X_33重组毕赤酵母菌液上清的滤纸片。图19显示的是石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组蛋白对大肠杆菌抑菌实验结果:1为加有Ampicillin的滤纸片，2为加有转入pPICZ a A的酵母菌液上清的滤纸片，3为加有已诱导表达的pPICZ a A- LEAP-2-X-33重组毕赤酵母菌液上清的滤纸片。实验共设置5个上清蛋白浓度梯度，分别为(2c)°、(2c)(2c)_2、(2c)_3、(2c)_4，每个浓度梯度3个重复。实验结果表明，LEAP-2重组蛋白对溶藻弧菌、维氏气单胞菌和大肠杆菌的MIC分别为(2c)_4、(2c)_3、(2c)'这一数据说明LEAP-2重组前体蛋白对溶藻弧菌和维氏气单胞菌的抑制效果较为明显，而对大肠杆菌抑制效果不太明显。
[0048]十九、斜带石斑鱼抗菌肽mLEAP-2抗菌活性检测实验
根据上面的方法检测LEAP-2成熟肽对溶藻弧菌的抑菌效果，实验结果见图21。I为加有ddH20的滤纸片，2为加有转入pPICZ a A的酵母菌液上清的滤纸片，3为加有已诱导表达的pPICZ α A- mLEAP-2 -X-33重组毕赤酵母菌液上清的滤纸片，4为加有Ampicillin的滤纸片。实验结果表明，抗菌肽mLEAP-2对溶藻弧菌具有明显的抑制效果。
[0049]以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的`任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【权利要求】
1.石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示，或者是SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。
2.编码权利要求1所述石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其含有SEQID N0.1第262-561 bp所示的核苷酸序列。
4.石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.4所示，或者是SEQID N0.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。
5.编码权利要求4所述石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其为SEQID N0.1第421-561 bp所示的核苷酸序列，或者是SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
7.携带有权利要求2、3、5或6所述基因的载体。
8.含有权利要求2、3、5或6所述基因的重组菌株。
9.生产石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白或石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的方法，包括将携带有权利要求2、3、5或6所述基因的表达载体导入宿主细胞中，表达得到LEAP-2前体蛋白或LEAP-2成熟肽蛋白。
10.权利要求1或4所述的蛋白在制备抗菌制剂或提高水产动物免疫力制剂中的应用。
【文档编号】A23K1/17GK103755795SQ201410027857
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2013年3月18日
【发明者】王维娜, 谢福星, 刘媛 申请人:华南师范大学