一种Oscheius tipulae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用的制作方法
【专利摘要】一种Oscheius?tipulae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用，本发明涉及冻存液及其制备方法及该冻存液的应用。本发明要解决常规线虫甘油冻存液无法冷冻保种Oscheius?tipulae线虫的问题。冻存液由琼脂胶、四氢呋喃和缓冲液组成；制备方法：一、制备缓冲液；二、制备琼脂胶；三、制备冻存液；该冻存液用于Oscheius?tipulae线虫的冻存。本发明冻存的Oscheius?tipulae线虫解冻复苏后正常生长繁殖，保证了对野外捕获的Oscheius?tipulae线虫进行室内培养的可持续性。本发明用于Oscheius?tipulae线虫的冻存。
【专利说明】—种Oscheius t i pu I ae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及冻存液及其制备方法及该冻存液的应用。
【背景技术】
[0002]Oscheius tipulae为小杆科线虫,与秀丽隐杆线虫C.elegans具有相近的生态位和相似的生活型。发明人在野外捕获了 Oscheius tipulae并在室内培养成功。大多数线虫在以甘油为主要成分的冻存液中，于_80°C可长期保存，在室温下复苏后可正常生长繁殖。但Oscheius tipulae在甘油冻存液中无法复苏,进一步研究发现甘油对Oscheius tipulae具有致命毒性。因此常规的甘油冻存液对Oscheius tipulae的长期保存不适用。
【发明内容】
[0003]本发明要解决常规线虫甘油冻存液无法冷冻保种Oscheius tipulae线虫的问题，而提供一种Oscheius tipulae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用。
[0004]一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由5%~15%的琼脂胶、10%~20%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成；
[0005]其中缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为 0.001g/mL ；
[0006]所述琼脂胶的制备方法如下:
[0007]a、将KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中Iffl2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4 的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为
0.001g/mL ；
[0008]b、将琼脂加入步骤a制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶，其中，琼脂与缓冲液的质量体积比为(0.02g ~0.03g): IOmL0
[0009]—种Oscheius tipulae线虫冻存液的制备方法,具体按以下步骤进行:
[0010]一、将KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4 的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为
0.001g/mL ；
[0011]二、将琼脂加入步骤一制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°c，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶；
[0012]三、将步骤二得到的琼脂胶研碎，再加入步骤一制备的缓冲液，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，得到一种Oscheius tipulae线虫冻存液,其中，按体积百分含量琼脂胶为5%~15%、四氢呋喃为10%~20%、余量为缓冲液。[0013]上述冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存。
[0014]本发明制备出一种不含甘油的适用于Oscheius tipulae长期保持的冻存液，保证了 Oscheius tipulae室内研究的可持续进行。
[0015]本发明的有益效果是:本发明解决了常规线虫甘油冻存液无法冷冻保种Oscheiustipulae线虫的问题。利用本发明的线虫冻存液可长期保种Oscheius tipulae线虫。本发明冻存的Oscheius tipulae线虫解冻复苏后正常生长繁殖,保证了对野外捕获的Oscheiustipulae线虫进行室内培养的可持续性。
[0016]本发明用于Oscheius tipulae线虫的冻存。
【具体实施方式】
[0017]本发明技术方案不局限于以下所列举的【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】之间的任意组合。
[0018]【具体实施方式】一:本实施方式一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由5%~15%的琼脂胶、10%~20%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成；
[0019]其中缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为 0.001g/mL ；
[0020]所述琼脂胶的制 备方法如下:
[0021]a、将KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4 的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为
0.001g/mL ；
[0022]b、将琼脂加入步骤a制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶，其中，琼脂与缓冲液的质量体积比为(0.02g ~0.03g): IOmL0
[0023]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:一种Oscheiustipulae线虫冻存液按体积百分含量由8%~11%的琼脂胶、12%~18%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。其它与【具体实施方式】一相同。
[0024]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:一种Oscheiustipulae线虫冻存液按体积百分含量由6%的琼脂胶、11%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。其它与【具体实施方式】一相同。
[0025]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:一种Oscheiustipulae线虫冻存液按体积百分含量由13%的琼脂胶、19%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。其它与【具体实施方式】一相同。
[0026]【具体实施方式】五:【具体实施方式】一所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液的制备方法，具体按以下步骤进行:
[0027]一、将KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4 的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为
0.001g/mL ；[0028]二、将琼脂加入步骤一制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶；
[0029]三、 将步骤二得到的琼脂胶研碎，再加入步骤一制备的缓冲液，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，得到一种Oscheius tipulae线虫冻存液,其中，按体积百分含量琼脂胶为5%~15%、四氢呋喃为10%~20%、余量为缓冲液。
[0030]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】五不同的是:步骤二中琼脂与缓冲液的质量体积比为(0.02g~0.03g): 10mL。其它与【具体实施方式】五相同。
[0031]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】五不同的是:步骤三中按体积百分含量琼脂胶为10%。其它与【具体实施方式】五相同。
[0032]【具体实施方式】八:【具体实施方式】一所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存。
[0033]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是:该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存,具体操作如下:
[0034]A、将KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4 的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为
0.001g/mL ；
[0035]B、取各发育阶段的Oscheius tipulae幼虫、成虫及虫卵，用步骤A制备的缓冲液清洗干净，然后放入【具体实施方式】一所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液中，再放入温度为-73°C~_80°C的冰箱中，完成Oscheius tipulae线虫的冻存。其它与【具体实施方式】八相同。
[0036]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是:步骤二中冰箱温度为-78V。其它与【具体实施方式】八相同。
[0037]采用以下实施例验证本发明的有益效果:
[0038]实施例一:
[0039]本实施例一种Oscheius tipulae线虫冻存液的制备方法,具体按以下步骤进行:
[0040]一、将KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4 的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.005g/mL、MgSO4 的浓度为 0.001g/mL ；
[0041]二、将琼脂加入步骤一制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶，其中，琼脂与缓冲液的质量体积比为 0.03g: IOmL ；
[0042]三、将步骤二得到的琼脂胶研碎，再加入步骤一制备的缓冲液，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，得到一种Oscheius tipulae线虫冻存液,其中，按体积百分含量琼脂胶为15%、四氢呋喃为20%、余量为缓冲液。
[0043]该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存,具体操作如下:
[0044]A、将KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4 的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.005g/mL、MgSO4 的浓度为 0.001g/mL ；[0045]B、取各发育阶段的Oscheius tipulae幼虫、成虫及虫卵，用步骤A制备的缓冲液清洗干净，然后放入本实施例所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液中，再放入温度为_80°C的冰箱中，完成Oscheius tipulae线虫的冻存。 [0046]本实施例冻存的Oscheius tipulae线虫解冻复苏后正常生长繁殖,保证了对野外捕获的Oscheius tipulae线虫进行室内培养的可持续性。
【权利要求】
1.一种Oscheius tipulae线虫冻存液,其特征在于一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由5%~15%的琼脂胶、10%~20%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成； 其中缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为 0.001g/mL ； 所述琼脂胶的制备方法如下: a、将KH2P04、Na2HP04、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HP04的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为 0.001g/mL ； b、将琼脂加入步骤a制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶，其中，琼脂与缓冲液的质量体积比为(0.02g ~0.03g): 10mT,η
2.根据权利要求1所述的一种Oscheiustipulae线虫冻存液，其特征在于一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由8%~11%的琼脂胶、12%~18%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。
3.根据权利要求1所述的一种Oscheiustipulae线虫冻存液，其特征在于一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由6%的琼脂胶、11%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。
4.根据权利要求1所述的一种Oscheiustipulae线虫冻存液，其特征在于一种Oscheius tipulae线虫 冻存液按体积百分含量由13%的琼脂胶、19%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。
5.如权利要求1所述的一种Oscheiustipulae线虫冻存液的制备方法,其特征在于具体按以下步骤进行: 一、将KH2P04、Na2HPO4,NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HP04的浓度为 0.006g/mL> NaCl 的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为 0.001g/mL ； 二、将琼脂加入步骤一制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶； 三、将步骤二得到的琼脂胶研碎，再加入步骤一制备的缓冲液，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，得到一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其中，按体积百分含量琼脂胶为5%~15%、四氢呋喃为10%~20%、余量为缓冲液。
6.根据权利要求5所述的一种Oscheiustipulae线虫冻存液的制备方法,其特征在于步骤二中琼脂与缓冲液的质量体积比为(0.02g~0.03g): 10mL。
7.根据权利要求5所述的一种Oscheiustipulae线虫冻存液的制备方法,其特征在于步骤三中按体积百分含量琼脂胶为10%。
8.如权利要求1所述的一种Oscheiustipulae线虫冻存液的应用，其特征在于该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存。
9.根据权利要求8所述的一种Oscheiustipulae线虫冻存液的应用，其特征在于该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存,具体操作如下: A、将KH2P04、Na2HP04、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120°C，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HP04的浓度为 0.006g/mL、NaCl 的浓度为 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的浓度为 0.001g/mL ； B、取各发育阶段的Oscheius tipulae幼虫、成虫及虫卵，用步骤A制备的缓冲液清洗干净，然后放入权利要求1所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液中，再放入温度为-73°C~_80°C的冰箱中，完成Oscheius tipulae线虫的冻存。
10.根据权利要求8所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液的应用，其特征在于步骤二中冰箱温 度为-78V。
【文档编号】A01N1/02GK103891710SQ201410085826
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】王云彪, 郭泰亮 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所