甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘蓝型油菜控制开花相关的BNGI基因序列；所述序列编码SEQ?ID?NO.2所述的氨基酸序列。利用本发明的甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因，利用转基因、基因干扰以及基因敲除等技术分析其对甘蓝型油菜开花早晚的影响。也可研究BnGI基因在响应生物节律钟信号上的作用机制，结合育种技术获得适宜的早晚熟材料，为甘蓝型油菜的生产提供理论和实践的指导。
【专利说明】甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】的基因序列，具体涉及一种甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列。
【背景技术】
[0002]植物从营养生长过渡到生殖生长所经历的生理变化是内源和外源信号响应的的结果，这些信号作用导致植物的开花。开花是植物由营养生长到生殖生长的转折点，开花时间与作物收获时间、产量及种植适应性有重要的关联。调控植物开花的基因研究从不同调控途径展开以模式植物拟南芥为基础进行已经取得了较多的成果。
[0003]GI (GIGANTEA)是重要的生物节律钟输出基因，在光周期和生物节律钟调节开花途径中有着重要的作用。GI位于开花促进基因CO、FT的上游，受昼夜节律的调控，上调下游开花促进基因，在光周期介导开花的过程中有一定的调节作用。首先在拟南芥中分离出GI基因，并证明其表达由生物节律钟调控，目前，在大豆、菊花、大麦、朵蝶兰等植物中GI基因已被克隆和报道。
[0004]甘蓝型油菜(Brassica napus L )是十分重要的油料作物，是国产食用植物油的第一大来源，在我国食用油市场中具有举足轻重的地位。有关甘蓝型油菜开花相关基因的研究主要集中于FLC、FR 1、CO、FT等少数几个基因上，而GI基因在甘蓝型油菜中未见有克隆的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列。该基因cDNA全长4153bp，编码区全长为3516bp，编码1171个氨基酸。根据BnGI基因在甘蓝型油菜不同组织中的表达量分析初步探索了该基因的表达模式，为进一步研究该基因在调控开花中的作用机制打下基础。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007]第一方面，本发明涉及一种甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]优选地，所述基因序列如SEQ ID N0.1第I~3516位所示。
[0009]第二方面，本发明涉及一种前述BnGI基因序列的克隆方法，所述方法包括如下步骤:
[0010]I)甘蓝型油菜组织总RNA的提取；
[0011]2)以白菜GI基因gi登录号328684600作为种子序列，本地检索甘蓝型油菜EST数据包，利用电子克隆的技术，将检索到的目标EST拼接组装成甘蓝型油菜的BnGI基因；根据该BnGI基因，设计能够扩增出全长的基因特异引物:
[0012]如SEQ ID N0.4 所示的 GI_F,
[0013]如SEQ ID N0.5 所示的 GI_R ；[0014]3)以甘蓝型油菜组织RNA反转录得到的甘蓝型油菜cDNA为模板，利用所述基因特异引物GI_F、GI_R克隆出BnGI基因的全长cDNA序列。
[0015]第三方面，本发明涉及一种前述甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列在制备甘蓝型油菜品种中的用途，所述用途为采用基因工程手段或者基因干扰方法，调控所述基因序列的表达水平，进而引起甘蓝型油菜开花调控机制的变化，获得开花时间不同的甘蓝型油菜品种。
[0016]本发明根据NCBI数据库，运用生物信息学手段，通过同源序列比对设计出基因特异引物，用分子克隆的方法，克隆出甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因；经过序列分析，确定是甘蓝型油菜BnGI基因；组织表达分析表明，BnGI在不同组织中均有表达，但表达量具有组织差异性。
[0017]本发明具有的有益效果为:在BnGI基因的研究上，还可以继续利用相关序列信息扩增出BnGI基因的全长DNA序列，利用转基因、基因干扰以及基因敲除等技术分析其对油菜开花早晚的影响。也可以研究BnGI基因在响应生物节律钟信号上的作用机制，同时结合育种技术获得适宜的早晚熟材料，为甘蓝型油菜的生产提供理论和实践的指导。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0019]图1为本发明BnGI基因cDNA全长扩增的凝胶电泳图；其中，a为BnGI基因的克隆，b为PCR鉴定大肠杆菌DH5 α转化子；图中BnGI =BNGI基因cDNA全长；1_4 =BnGI基因cDNA 全长 DH5 α 转化子的 PCR 产物；M:DL5000Maker ；
[0020]图2为本发明BnGI基因在甘蓝型油菜植株不同组织中表达量示意图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0022]下列实施例涉及的UNIQ-10总RNA抽提试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒Taq DNA聚合酶等通过公开市售的商业渠道获得，购于生工生物工程(上海)股份有限公司，地址:上海市松江区香闵路698号。实验所用的反转录PrimeScript RT-PCRKit、高保真的 PrimeSTARi Max DNA 聚合酶、pMD19_T Vector CloningKit、SYBR8 Premix Ex Taq?荧光半定量试剂盒等购于宝生物工程(大连)有限公司，公司地址:辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号。
[0023]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等(1989)编著的分子克隆实验手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0024]实施例1、甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因的克隆和表达特性分析
[0025] 1、甘蓝型油菜实验材料取材[0026]本实验所用甘蓝型油菜为利用上海市农业科学院自选早熟、园叶的自交系‘10-4544’母本与复交组合[(中双2号X沪油15)X(沪油15X花叶)]中选育的自交系的父本材料杂交后F1进行小孢子培养所得DH系材料。
[0027]2、提取甘蓝型油菜组织总RNA
[0028]取甘蓝型油菜各组织样品用于RNA提取，按照UNIQ-10总RNA抽提试剂盒要求，具体操作步骤如下:
[0029](1)各取甘蓝型油菜组织材料0.2-0.4g左右，利用液氮将材料速冻然后快速碾磨至粉状；
[0030](2)将上述研磨样品转移到一个没有RNA酶的2ml EP管中，用移液枪吸取450 μ IRLT溶液溶解粉状试验材料，使用涡旋混合器将溶液与粉状物在外力帮助下混合均匀，放入离心机12000转，5min，然后将不含沉淀的液体转入没有使用过的不含RNA酶的
1.5ml EP 管中；
[0031](3)向转出的不含沉淀的液体中中加入其I / 2体积的无水乙醇并上下翻转使其混合均匀，放置Imin ；
[0032](4)将试剂盒中吸附柱放入对应编号的的回收管中，用移液枪吸取上一步骤中混匀溶液悬空注入组装后的收集管，放置3min后使其充分反应后放入离心机,8000转，Imin后取出收集管，将吸附柱下面的液体弃掉；
[0033](5)向上一步骤中的收集管中加入500μ I RW溶液，放置几十秒后放入离心机10000转,Imin后取出收集管,吸附柱下面的液体仍弃掉；
[0034](6)再向上述处理后的收集管中加入500 μ I RPE溶液，放置2min，再次放入离心机10000转，Imin后取出收集管；
[0035](7)重复上述处理；
[0036](8)取出收集管后，将两次处理离心后产生的废液弃掉，将没有液体的吸附柱和收集管组装后再次放入离心机，10000转，2min后拿出收集管，用移液枪将管壁上残余的液体吸干；
[0037](9)将吸附柱放入处理过不含RNA酶的1.5ml EP管中，吸取40 μ I DEPC处理过的无菌水，缓慢加至吸附柱膜中间位置，放置5min，在离心机中12000转离心。两分钟后拿出EP管，在1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的样品RNA的质量后保存于_20°C或超低温冰箱保存以备后用。
[0038]3、甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因的克隆
[0039]以拟南芥GIGANTEA基因为种子序列，在NCBI检索非冗余蛋白库，将检索到的在种间关系上更接近甘蓝型油菜的白菜GI基因gi登录号328684600作为种子序列，本地检索甘蓝型油菜EST数据包。利用电子克隆的技术，将检索到的目标EST进行拼接组装成甘蓝型油菜的BnGI基因。通过对电子克隆的BnGI基因的ORF进行分析，设计能够扩增出全长的基因特异引物(表1)。将甘蓝型油菜组织RNA利用PrimeScript RT-PCRKit试剂盒反转录得到甘蓝型油菜cDNA，以此为模板，以GI_F / R为引物，采用PrimeSTARs MaxDNA高保真酶反应体系，进行目的片段的扩增。反应参数为:94°C预变性4min ;98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸4min共35个循环；72°C延伸20min ;4°C结束反应。将PCR产物进行凝胶电泳检测如图1a可知经设计引物扩增所得产物片段大小约为4000bp左右，与电子克隆技术预测结果相同，即所得为BnGI基因目的片段。
[0040]将符合目的片段大小的PCR产物纯化后克隆至pMD-19T vector (Takara)，导入大肠杆菌菌株，经d互补和M13通用引物进行检测，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测菌液PCR产物，如图1b中所示片段大小正确的阳性转化子送Life technology公司测序。通过结合电子克隆技术的同源克隆方法得到甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因cDNA全长序列，编码区长度为3516bp，推导编码1171个氨基酸，cDNA编码区序列和推导蛋白序列见SEQID.N0.1 币口 SEQ ID.N0.2。
[0041]表1本发明基因克隆所用引物
[0042]
【权利要求】
1.一种甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列，其特征在于，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.如权利要求1所述的BnGI基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQID N0.1第I~3516位所示。
3.—种如权利要求1或2所述的BnGI基因序列的克隆方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 1)甘蓝型油菜组织总RNA的提取； 2)以白菜GI基因gi登录号328684600作为种子序列，本地检索甘蓝型油菜EST数据包，利用电子克隆的技术，将检索到的目标EST拼接组装成甘蓝型油菜的BnGI基因；根据该BnGI基因，设计能够扩增出全长的基因特异引物:
如 SEQ ID N0.4 所示的 GI_F,
如 SEQ ID N0.5 所示的 GI_R ； 3)以甘蓝型油菜组织RNA反转录得到的甘蓝型油菜cDNA为模板，利用所述基因特异引物GI_F、GI_R克隆出BnGI基因的全长cDNA序列。
4.一种如权利要求1所述的甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列在制备甘蓝型油菜品种中的用途，其特征在于，所述用途为采用基因工程手段或者基因干扰方法，调控所述基因序列的表达水平，进而引起甘蓝型油菜开花调控机制的变化，获得开花时间不同的甘蓝型油菜品种。
【文档编号】A01H5/00GK103923929SQ201410100829
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】刘杨, 周晓晨, 韩洪强, 刘畅, 赵越 申请人:上海交通大学