波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法
【专利摘要】波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，属于植物培育【技术领域】。其特征在于包括：1）无菌苗培养；2）诱导愈伤组织培养；3）增殖培养；4）诱导生根培养；5）炼苗后移栽管理。上述波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，利用植物组织培养，通过离体快速繁殖，在以下三方面存在重要意义：（1）繁殖速度快，生产周期短，一年四季在室内均可繁殖，启动快；（2）充分利用有限的植物资源；（3）便于保持优良植物品质。采用该方法，愈伤组织诱导率为98.9%以上；芽增殖率为100%，倍数可达3.85以上；生根率为100%，平均长度可达1.44cm以上，再生植株平均根数为5.3条以上；且操作简单，繁殖速度快，具有很好的市场前景。
【专利说明】波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物培育【技术领域】，具体为波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法。
【背景技术】
[0002]波叶蔓虎刺undulata Sieb.& Zucc)，多年生匍匐性草本，茎纤细，全株无毛，深绿色。叶对生，有大小二型之分，大型叶三角状卵形或卵形，长1-2.1 cm，宽7-15mm,顶端急尖或圆，基部截平或圆，边缘具波状疏齿，两面无毛，薄革质，羽状脉，侧脉每边2-3条,两面不明显；叶柄长达1.1 cm,无毛或近无毛；小型叶卵形或正圆形,长2-3 mm ;托叶生于叶柄间，三角形。花有长花柱短雄蕊及短花柱长雄蕊二型，每两朵成对顶生其下具长约8毫米的总花梗，子房4室，每室I胚珠，柱头4裂。；花萼宽钟形，顶部具3-6齿；花冠白色而常多少带红晕，漏斗形，长约15 _，喉部和裂片内面被毛，萼檐顶部4裂，苞时镊合状；果实为浆果2枚合生，4分核，熟时红色，直径约8 mm。花期8月，果期8_9月。分布于朝鲜半岛南部和日本，中国仅台湾有I种，极其稀有。
[0003]浙江近年新发现，也为我国大陆首次发现，仅分布在遂昌、龙泉、庆元海拔700-1600米的溪边林下湿润岩石上，资源极其稀缺，已列入浙江极小种群野生植物，其中浙江发现的种叶片(长0.6-1.2 Cm，宽0.5-1.1 cm)、叶柄(长1_3臟)、总花梗(长2-3 mm)、花冠(长约10 mm)及果实(直径5 mm)均较日本产的本种植物为小，亟待开展繁育与保育的研究。国内外对于波叶蔓虎刺的研究很少，因此，研究和开发波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，对于野生波叶蔓虎刺的保育和开发利用具有极大的意义。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法的技术方案，其繁殖速度快，生产周期短，一年四季在室内均可繁殖，启动快。
[0005]所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于包括以下步骤:
1)选取生长健壮的野生波叶蔓虎刺茎段依次用70%乙醇浸泡25-30s，0.l%HgCl2浸泡10-15min，然后用无菌水冲洗3_4次，将灭菌的波叶蔓虎刺茎段外植体剪成长约1.0-1.5cm的无节茎段，接种于MS+BA2.0-2.5 mg/L+NAA0.2-0.3 11^/1+琼脂7.5 -8.0g/L+蔗糖 25-30g/L、且pH处于5.8-6.2之间的培养基中进行培养获得无菌苗，培养温度为24-28°C，光照强度为1200-1800 lx，光照时数为12-14 h/d ；
2)待无菌苗长到长约5-6cm时，将无菌苗剪切成无节茎段，每个茎段长1.0 -1.5cm,接种到 MS+NAA0.5-0.7 mg/L+6-BAl.5-2.0 mg/L+琼脂 7.0-7.5 g/L+蔗糖 30-32 g/L、且pH为5.7-5.9的诱导愈伤组织培养基中进行培养50-60 d，培养温度为25_27°C，光照强度为 1300-1600 lx，光照时数为 13-14 h/d ；
3)将经过步骤2)愈伤组织诱导获得的无菌苗剪切成的茎段包含一个节两片叶，或者两个节四片叶不带顶芽，接种到含有MS+NAA0.1-0.2 mg/L+6-BAl.0-1.3 mg/L+琼脂7.2-7.5g/L+蔗糖28-32 g/L、且pH为5.8-5.9的增殖培养基中培养50-60 d，培养温度为26-28°C，光照强度为1400-1700 lx，光照时数为11-12 h/d ；
4)将经过步骤3)增殖培养的无菌苗剪切成含有四个节且带顶芽的茎段接种到含有MS+NAA0.5-0.7 mg/L+ 琼脂 7.4-7.6 g/L+ 蔗糖 25-29 g/L、且 pH 为 5.8-5.9 的诱导生根培养基中培养55-60 d，培养温度为24-26°C，光照强度为1600-1700 lx，光照时数为14-15 h/d ；
5)待诱导生根培养基中植株长到约4-5cm高时，将培养基打开瓶盖后转移到自然光下炼苗10-15 d，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，稍晾干根部的水分即可进行移栽，移入经消毒过的蛭石:珍珠岩:泥炭体积比为0.5-1:0.6-1.2:0.8-1.5的混合基质中；基质移栽前用50%的多菌灵可湿性粉剂的800倍进行基质消毒，消毒后将基质装入直径10-12 cm，深度12-15 cm的花盆中，移栽完成后盖上塑料薄膜，湿度保持在85%以上，移栽10 d后逐渐降低湿度，30 d后进行常规管理。
[0006]所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤I)中:所述的培养基为 MS+BA2.2-2.3 mg/L+NAA0.25 mg/L+琼脂 7.6 -7.8g/L+蔗糖 28 g/L、且 pH 处于
5.9-6.0 ;培养温度为25-27°C，光照强度为1400-1600 lx，光照时数为13h/d。
[0007]所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤2)中:诱导愈伤组织培养基为 MS+NAA0.55-0.6mg/L+6-BAl.6-1.8 mg/L+琼脂 7.2-7.4 g/L+蔗糖 28-29 g/L、且pH为5.8，培养温度为26°C，光照强度为1350-1550 lx，光照时数为14 h/d。
[0008]所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤3)中:增殖培养基为 MS+NAA0.15mg/L+6-BAl.1-1.2 mg/L+ 琼脂 7.2-7.4 g/L+ 蔗糖 30 g/L、且 pH 为 5.8，培养温度为27°C，光照强度为1500-1600 lx，光照时数为11 h/d。
[0009]所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤4)中:诱导生根培养基为MS+NAA0.6mg/L+琼脂7.5g/L+蔗糖26-27 g/L,培养温度为，25°C，光照强度为1650lx，光照时数为15 h/d。
[0010]所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤5)中:所述栽培基质为蛭石:珍珠岩:泥炭体积比为0.6-0.8:0.8:1.0:1.2-1.3。
[0011]所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于pH用无机酸或无机碱调整。
[0012]所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于上述各培养基接种前经高温121。。、高压1.1-1.2 kg/cm2消毒20-25分钟，冷却待用。
[0013]所述的MS为常规基本培养基Murashige&Skoog (1962)，NAA为萘乙酸，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤。
[0014]本发明中培养基的的浓度及配方不同、培养条件不同、基质组成和品质、不同的管理对成品率均有显著影响。
[0015]上述波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，利用植物组织培养，通过离体快速繁殖，在以下三方面存在重要意义:(1)繁殖速度快，生产周期短，一年四季在室内均可繁殖，启动快；(2)充分利用有限的植物资源；(3)便于保持优良植物品质。采用该方法，愈伤组织诱导率为98.9%以上；芽增殖率为100%，倍数可达3.85以上；生根率为100%，平均长度可达1.44 cm以上，再生植株平均根数为5.3条以上；且操作简单，繁殖速度快，具有很好的市场前景。
[0016]本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，均指重量百分含量。
【具体实施方式】
[0017]现结合本发明的实施例，进一步说明本发明的有益效果。
[0018]实施例1:
选取生长健壮的野生波叶蔓虎刺茎段依次用70%乙醇浸泡30s，0.l%HgCl2浸泡lOmin，然后用无菌水冲洗3-4次，将灭菌的波叶蔓虎刺茎段外植体剪成长约1.0cm的无节茎段，接种于MS+BA2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+琼脂 7.5 g/L蔗糖 30 g/L，且pH处于 5.8-6.2 之间的培养基中进行培养获得无菌苗。培养温度为24-28°C，光照强度为1200-1800 lx，光照时数为12-14 h/d。待无菌苗长到长约5-6 cm时，将无菌苗剪切成无节茎段，每个茎段长1.0 cm,接种到 MS+NAA0.5 mg/L+6-BA2.0 mg/L+ 琼脂 7.5 g/L 蔗糖 30 g/L,且 pH 为 5.8 的诱导愈伤组织培养基中进行培养，60 d时愈伤组织诱导率为98.9% ;将获得的无菌苗处理成包含两个节四片叶(不带顶芽)的茎段接种到含有MS+NAA0.1 mg/L+6-BAl.0 mg/L+琼脂7.5 g/L蔗糖30 g/L，且pH为5.8的增殖培养基中培养，60 d后芽增殖率为100%，倍数可达3.85 ;将获得的无菌苗剪切成含有四个节且带顶芽的茎段接种到含有MS+NAA0.5 mg/L+琼脂7.5g/L蔗糖30 g/L,且pH 为5.8的诱导生根培养基中培养，60 d后生根率为100%，平均长度可达1.44 cm，再生植株平均根数为5.3条。以上各阶段培养温度为24_28°C，光照强度为1200-1800 lx，光照时数为12-14 h/d。待诱导生根培养基中植株长到约4_5 cm高时，将培养基打开瓶盖后转移到自然光下炼苗10-15 d，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，稍晾干根部的水分即可进行移栽，移入经消毒过的蛭石:珍珠岩:泥炭为1:1:1的混合基质中。基质移栽前用50%的多菌灵可湿性粉剂的800倍进行基质消毒，消毒后将基质装入直径10 cm，深度12 cm的花盆中，移栽完成后盖上塑料薄膜。湿度保持在85%以上，移栽
10d后逐渐降低湿度，30 d后进行常规管理。
[0019]实施例2:
选取生长健壮的野生波叶蔓虎刺茎段依次用70%乙醇浸泡25s，0.l%HgCl2浸泡15min，然后用无菌水冲洗3-4次，将灭菌的波叶蔓虎刺茎段外植体剪成长约1.0cm的无节茎段，接种于 MS+BA2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+ 琼脂 7.5 g/L 蔗糖 30 g/L,且 pH 处于 5.8-6.2 之间的培养基中培养获得无菌苗。培养温度为24-28°C，光照强度为1200-1800 lx，光照时数为12-14 h/d。待无菌苗长到长约5-6 cm时，将无菌苗剪切成无节茎段，每个茎段长1.0 cm,接种到 MS+NAA0.5 mg/L+6-BA2.0 mg/L+ 琼脂 7.5 g/L 蔗糖 30 g/L,且 pH 为 5.8 的诱导愈伤组织培养基中培养，60 d时愈伤组织诱导率为98.9% ;将获得的苗处理成包含一个节两片叶(不带顶芽)的茎段接种到含有MS+NAA0.1 mg/L+6-BAl.5 mg/L+琼脂7.5 g/L蔗糖30g/L,且pH为5.8的增殖培养基中培养，60 d后芽增殖率为100%，增殖倍数为2.84 ;将获得的无菌苗剪切成包含三个节带顶芽的茎段接种到含有MS+NAA0.5 mg/L+琼脂7.5 g/L蔗糖30 g/L,且pH为5.8的诱导生根培养基中培养，60d后生根率为100%，再生植株平均长度可达1.22 cm，平均根数为3.75条。以上各阶段培养温度为24_28°C，光照强度为1200-1800lx，光照时数为12-14 h/d。待诱导生根培养基中再生植株长到约4-5 cm高时，将培养基打开瓶盖后转移到自然光下炼苗10-15 d，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，稍晾干根部的水分即可进行移栽，移入经消毒过的蛭石:珍珠岩:泥炭为0.5:0.8:1.5的混合基质中。基质移栽前用50%的多菌灵可湿性粉剂的800倍进行基质消毒，消毒后将基质装入直径10 cm，深度12 cm的花盆中，移栽完成后盖上塑料薄膜。湿度保持在85%以上，移栽10 d后逐渐降 低湿度，30 d后进行常规管理。
【权利要求】
1.波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于包括以下步骤: 1)选取生长健壮的野生波叶蔓虎刺茎段依次用70%乙醇浸泡25-30s，0.l%HgCl2浸泡10-15min，然后用无菌水冲洗3_4次，将灭菌的波叶蔓虎刺茎段外植体剪成长约1.0-1.5cm的无节茎段，接种于MS+BA2.0-2.5 mg/L+NAA0.2-0.3 11^/1+琼脂7.5 -8.0g/L+蔗糖 25-30g/L、且pH处于5.8-6.2之间的培养基中进行培养获得无菌苗，培养温度为24-28°C，光照强度为1200-1800 lx，光照时数为12-14 h/d ； 2)待无菌苗长到长约5-6cm时，将无菌苗剪切成无节茎段，每个茎段长1.0 -1.5cm,接种到 MS+NAA0.5-0.7 mg/L+6-BAl.5-2.0 mg/L+琼脂 7.0-7.5 g/L+蔗糖 30-32 g/L、且pH为5.7-5.9的诱导愈伤组织培养基中进行培养50-60 d，培养温度为25_27°C，光照强度为 1300-1600 lx，光照时数为 13-14 h/d ； 3)将经过步骤2)愈伤组织诱导获得的无菌苗剪切成的茎段包含一个节两片叶，或者两个节四片叶不带顶芽，接种到含有MS+NAA0.1-0.2 mg/L+6-BAl.0-1.3 mg/L+琼脂7.2-7.5g/L+蔗糖28-32 g/L、且pH为5.8-5.9的增殖培养基中培养50-60 d，培养温度为26-28°C，光照强度为1400-1700 lx，光照时数为11-12 h/d ； 4)将经过步骤3)增殖培养的无菌苗剪切成含有四个节且带顶芽的茎段接种到含有MS+NAA0.5-0.7 mg/L+ 琼脂 7.4-7.6 g/L+ 蔗糖 25-29 g/L、且 pH 为 5.8-5.9 的诱导生根培养基中培养55-60 d，培养温度为24-26°C，光照强度为1600-1700 lx，光照时数为14-15 h/d ； 5)待诱导生根培养基中植株长到约4-5cm高时，将培养基打开瓶盖后转移到自然光下炼苗10-15 d，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，稍晾干根部的水分即可进行移栽，移入经消毒过的蛭石:珍珠岩:泥炭体积比为0.5-1:0.6-1.2:0.8-1.5的混合基质中；基质移栽前用50%的多菌灵可湿性粉剂的800倍进行基质消毒，消毒后将基质装入直径10-12 cm，深度12-15 cm的花盆中，移栽完成后盖上塑料薄膜，湿度保持在85%以上，移栽10 d后逐渐降低湿度，30 d后进行常规管理。
2.如权利要求1所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤I)中:所述的培养基为 MS+BA2.2-2.3 mg/L+NAA0.25 mg/L+琼脂 7.6 -7.8g/L+蔗糖 28 g/L、且pH处于5.9-6.0 ;培养温度为25-27°C，光照强度为1400-1600 lx，光照时数为13h/d。
3.如权利要求1所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤2)中:诱导愈伤组织培养基为 MS+NAA0.55-0.6mg/L+6-BAl.6-1.8 mg/L+ 琼脂 7.2-7.4 g/L+ 蔗糖28-29 g/L、且pH为5.8，培养温度为26°C，光照强度为1350-1550 lx，光照时数为14 h/d。
4.如权利要求1所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤3)中:增殖培养基为 MS+NAA0.15mg/L+6-BAl.1-1.2 mg/L+琼脂 7.2-7.4 g/L+蔗糖 30 g/L、且pH为5.8，培养温度为27°C，光照强度为1500-1600 lx，光照时数为11 h/d。
5.如权利要求1所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤4)中:诱导生根培养基为MS+NAA0.6mg/L+琼脂7.5g/L+蔗糖26-27 g/L,培养温度为，25°C，光照强度为1650 lx，光照时数为15 h/d。
6.如权利要求1所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于步骤5)中:所述栽培基质为蛭石:珍珠岩:泥炭体积比为0.6-0.8:0.8:1.0: 1.2-1.3。
7.如权利要求1所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于pH用无机酸或无机碱调整。
8.如权利要求1所述的波叶蔓虎刺组培快繁与植株再生方法，其特征在于上述各培养基接种前经高 温121°C、高压1.1-1.2 kg/cm2消毒20-25分钟，冷却待用。
【文档编号】A01G31/00GK103891616SQ201410130425
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】夏国华, 施晓灯, 屠茹萍, 傅晓强, 徐步青 申请人:浙江农林大学