甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法
【专利摘要】本发明甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法，包括：1）选育具有孤雌生殖遗传特性的四倍体早代稳定系；2）选育携带显性遗传性状且具有孤雌遗传特性的八倍体油菜。3）甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系鉴定及选育：选择带显性性状的上述八倍体植株与质不育或核不育的纯合不育系单株测交，并对测交后代进行形态鉴定及育性鉴定。本发明方法诱导效率极高。通过本发明获得的油菜诱导系，在油菜新材料、新品种选育中有广泛的应用，能提高油菜新品系或新品种纯合的速度，提高育种效率，快速选育优良保持系、恢复系及常规油菜新品种。
【专利说明】甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法
[0001]【技术领域】:
本发明与农业有关，特别与甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法有关。
[0002]【背景技术】:
甘蓝型油菜(Brassica napus,四倍体)新品种选育，首先是选育新的自交系或遗传稳定的株系纯合系，在抗性、产量、品质等要求上满足生产需要，最后审定为新的油菜新品种(常规品种)。正常情况下通过常规的人工杂交选育一个常规油菜品种需要6— 7代的时间，如果选育杂交品种，需要培育稳定的不育系、保持系、恢复系，油菜新品种选育时间更长，10 —15年。常规油菜新品系选育是通过两个遗传背景不同的品系杂交形成F1代，F1代自交形成F2代，F2代再选择优良单株自交形成F3代，F3再选单株自交，一直到F6-F7代才能获得稳定的油菜新品系，以I年I代计算，所花时间大概在7—8年的时间，通过异地加代也需要4年左右的时间。[0003]目前，在油菜中还未有诱导系的报道。所谓“诱导系”是指，用该植物作为父本用其花粉对同类植株授粉，能诱导同类植株(母本)产生相应的效应，如产生单倍体、纯合二倍体等。在植物中运用诱导系进行新品种选育最多的是玉米，但玉米中的诱导系也只是单倍体诱导系。最早出现的玉米单倍体诱导系为stock6，该诱导系只能诱导玉米产生单倍体，然后单倍体植株再进行人工染色体加倍形成纯合二倍体，且诱导效率较低，一般诱导效率在10%以下(以收获种子中获得单倍体数计算)。本发明所用方法能有效选育甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系，且该诱导系能直接诱导甘蓝型油菜产生纯合四倍体后代，无需进行人工染色体加倍来获得纯合系；且诱导效率高，最高可达100%，一般的诱导效率都在50%以上。诱导系诱导母体植株产生纯合四倍体的主要原理是:诱导系能诱导母体植株，大孢子生殖细胞(卵细胞)产生孤雌生殖效应，且卵细胞能进行染色体加倍，即卵细胞孤雌生殖产生的后代就为纯合的四倍体，产生该现象的机理目前尚不明确。
[0004]
【发明内容】
:
本发明的目的为了提供一种甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法。采用本发明方法获得甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系能诱导母体植株在F1代发生孤雌生殖，在F2代形成稳定的纯合四倍体，该方法能快速、有效，只需2代(I年或2年)获得稳定纯合系油菜，提高了油菜选育自交系或常规品种的周期。
[0005]本发明的目的是这样来实现的:
本发明甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法，该方法包括以下步骤:
I)选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系:
(I)将两个亲本材料杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍获得加倍后的F1代植株；
(2 )加倍后的F1代植株进行自交或强制自交获得F2代，对F2代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择四倍体可育后代自交获得F3代，对F3代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系-四倍体早代稳定系；
(3)获得的四倍体早代稳定系与至少10个常规纯合稳定系进行正反交，F1代、F2代鉴定早代稳定系的遗传特性，即是否有孤雌生殖特性；上述正反交，如有F1分离，F2代出现部分稳定株系，对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系；
2)选育携带显性遗传形状且具有孤雌遗传特性的八倍体油菜:
(1)具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交(如显性矮杆、紫叶、花叶、黄叶等性状)，得到杂交F1代种子。上述杂交F1种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显性性状的F1值株；
(2)对加倍的带显性性状的F1植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的八倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加倍植株；
3)甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系鉴定及选育:选择带显性性状的上述八倍体植株与质不育或核不育的纯合不育性单株测交，并对测交后代进行形态鉴定及育性鉴定:
(1)八倍体植株中的显性性状能去除测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株、或非四倍体植株，说明该植株是八倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株;
(2)上述单株测交后代如果出现全不育、为正常四倍体油菜、且不带显性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性八倍体植株为甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系。
[0006]上述的将两个亲本材料杂交F1代种子或具有孤雌生`殖遗传特性的四倍体早代稳定系与具有显性性状四倍体油菜杂交得到的杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍的具体方法如下:
1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25—40秒，用0.1%升汞消毒12 —17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基上；
2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件:温度23—25°C，白天光照12—16小时，光照强度2000— 3000勒克斯，夜晚暗培养8 —12小时，待植株长到I一2片真叶时，从下胚轴处剪下植株继续在第二培养基上生长；
3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基中进行生根培养；
4)生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3—7天，取出植株将植株上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15 — 30分钟后移栽到温室中，温室温度16°C — 25°C，相对湿度60— 80%，能保证移栽成活率在95%以上；
上述的第一培养基由以下配比的组分组成:
MS培养基IL
6—苄基腺嘌呤0.5— 1.5mg
染色体加倍诱导剂30— 70mg
蔗糖20— 30g
琼脂8 一IOg,第一培养基的pH=5.8—6.0，
上述的第二培养基由以下配比的组分组成:
MS培养基IL
6—苄基腺嘌呤0.5 — Img
染色体加倍诱导剂20— 40mg
蔗糖20— 30g
琼脂8 一IOg,
第二培养基的pH=5.8—6.0，
上述的第三培养基由以下配比的组分组成:
MS培养基IL
α—蔡乙酸0.03—0.5mg 染色体加倍诱导剂5 — 20mg
蔗糖20— 30g
琼脂8 一IOg,
第三培养基的pH=5.8—6.0，
上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成:
水IL
易保或克露0.6—1.2g
α一萘乙酸0.5—Img。
[0007]上述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。
[0008]上述诱导系(八倍体植株)的基本原理是:诱导系具有孤雌生殖诱导基因，诱导系作父本时，诱导系染色体(或基因)没有与母体植株染色体融合，而是诱导母体植株(即卵细胞，二倍体)产生孤雌生殖效应，且母体植株卵细胞染色体自身加倍形成四倍体纯合系。
[0009]上述选育成功的纯合四倍体诱导系(显性八倍体植株)，可以快速用于常规品种选育，杂交油菜亲本(恢复系、保持系)选育，同时可以快速培育DH系。可以在I年或2代的时间内获得上述材料，大大节约油菜的育种时间，提高育种效率。
[0010]本发明具有以下优点:
1、获得的诱导系诱导效率高，最高诱导效率可达100%。
[0011]2、诱导系作为父本与正常植株去雄杂交，结实率在10—20%，诱导产生的后代不需要人工染色体加倍，可直接产生纯合四倍体。
[0012]3、诱导系可诱导母本植株孤雌生殖，可在2代(I一2年)获得稳定纯合的四倍体油菜新材料或品种。
[0013]4、本发明可以用在油菜保持系、恢复系、DH群体构建以及常规油菜品种的选育上，可以在I年或2代的时间内获得稳定的油菜新品系或新品种。对于油菜品质育种、抗性育种、高油分育种、常规育种及杂交育种具有明显的优势，提高育种效率，降低育种成本和风险。
[0014]【专利附图】
【附图说明】:
图1为甘蓝型油菜纯合体四倍体诱导系选育过程图。
[0015]图2为诱导系3380选育流程图。图3为获得油菜早代稳定系的流程图。
[0016]图4为获得早代稳定系P3—2的流程图。
[0017]图5为P3—2四倍体油菜倍性鉴定图。
[0018]图6为P3—2流式细胞仪倍性鉴定图。
[0019]图7为3380流式细胞仪倍性鉴定图。
[0020]【具体实施方式】:
参见图1、图2，由本 申请人:获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系P3—2，与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交F1代出现分离，且这3个组合F2代出现稳定株系，说明P3 — 2具有孤雌生殖遗传特性。用P3 — 2与四倍体甘蓝型矮杆油菜D3 — 5正反交(矮杆为显性性状)，然后将杂交F1代种子进行染色体加倍，加倍后代用流式细胞仪鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆八倍体植株，该植株定名为3380。
[0021]参见图3~图6，获得四倍体早代稳定系P3 — 2方法如下:
甘蓝型油菜H)09 (四倍体，染色体2n=38)与白菜型油菜YH (二倍体，雅安黄油菜，染色体2n=20)剥蕾进行人工去雄杂交获得F1代杂交种子。F1代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍。对加倍后的F1代植株进行自交(或强制自交)获得F2代，对F2代进行田间种植观 察、育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性，出现三种情况(1、单倍体植株，花粉极少，且育性极低；2、多倍体植株完全不育，花器官发育受阻，不能正常的开花，无花粉；3、正常可育的植株，花粉量多，花粉育性95%以上)。对F2代正常可育单株进行自交获得F3代。对F3代进行纯合度鉴定，种植F3代单株株系，32%的可育株系单株植株整齐一致，开花结实正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致(38条)，染色体形态未出现异常。SSR分子标记，通过DNA聚合酶链反应，电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型，显示每个单株都是H)09与YH的杂交后代，且每个单株DNA扩增条带数目及带型一致，可以判断这些株系为纯合系，即早代稳定系。将其中I个叶片较大、无裂叶、叶片着生紧凑、含油率55%的甘蓝型(染色体38条)油菜早代稳定系定名为P3— 2。
[0022]本实施例中将F1代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下:
1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基(染色体加倍诱导培养基)上；
2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件:温度25°C，白天光照16小时，光照强度2000勒克斯，晚上暗培养8小时，待长到I一2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培养基上生长；
3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基(生根培养基)中进行生根培养；
4)生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3天后，取出植株将植株上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中，温室温度25°C，相对湿度60%，能保证移栽成活率在95%以上；
上述的第一培养基由以下配比的组分组成:
—MS培养基IL6—苄基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素30mg
鹿糖20g
琼脂8g。
[0023]第一培养基的ρΗ=5.8—6.0。
[0024]MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，其配方参见附表1。
[0025]上述的第二培养基由以下配比的组分组成:
MS培养基IL
6—苄基腺嘌呤(6ΒΑ) 0.5mg 秋水仙素20mg
鹿糖30g
琼脂8g。
[0026]第二培养基的ρΗ=5.8—6.0。
[0027]上述的第三培养基由以下配比的组分组成:` MS培养基IL
α 一萘乙酸0.03mg
秋水仙素5mg
鹿糖20g
琼脂8g。
[0028]第三培养基的ρΗ=5.8—6.0。
[0029]上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成:
水IL
易保或克露0.6g
α —萘乙酸0.5mg。
[0030]参见图2、图7，获得矮杆显性八倍体油菜3380的方法如下:
P3-2与甘蓝型矮杆油菜D3 — 5 (矮杆为显性性状)剥蕾进行人工去雄杂交获得F1代杂交种子。然后将杂交F1代种子在MS培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍。加倍后代用流式细胞仪鉴定倍性，倍性鉴定以P3 — 2为对照。
[0031]本实施例中将F1代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下:
1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基(染色体加倍诱导培养基)上；
2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件:温度25°C，白天光照16小时，光照强度2000勒克斯，晚上暗培养8小时，待长到I一2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培养基上生长；
3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基(生根培养基)中进行生根培养；
4)生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3天后，取出植株将植株上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中，温室温度25°C，相对湿度60%，能保证移栽成活率在95%以上；
上述的第一培养基由以下配比的组分组成:
MS培养基IL
6—苄基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素50mg
鹿糖20g
琼脂8g。
[0032]第一培养基的ρΗ=5.8—6.0,
MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，其配方参见附表1，
上述的第二培养基由以下配比的组分组成:
MS培养基IL
6—苄基腺嘌呤(6ΒΑ) 0.5mg 秋水仙素30mg
鹿糖30g
琼脂8g 。
[0033]第二培养基的ρΗ=5.8 — 6.0。
[0034]上述的第三培养基由以下配比的组分组成:
MS培养基IL
α 一萘乙酸0.03mg
秋水仙素20mg
鹿糖20g
琼脂8g
第三培养基的pH=5.8—6.0，
上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成:
水1L
易保或克露0.6g
α —萘乙酸0.5mg。
[0035]参见图2，用3380作父本，与甘蓝型油菜细胞质不育系(0464A)测交，测交后代50株，全为高杆，且全为四倍体油菜，其中49株为全不育，I株半不育，且形态特征与0464A完全相同。同时用P3 — 2与矮杆油菜D3 — 5杂交F1 (非加倍株)做父本与0464A测交作为对照验证，测交后代102株，出现矮杆62株、高杆40株、且育性分离较大，出现全可育73株、半不育20株、全不育9株。说明3380中的基因并未进入测交株，测交后代为0464A孤雌生殖而来，诱导率98%。用3380做父本与甘蓝型油菜3954去雄聚合杂交(3954为F1，由中双11与CAX杂交而来)，聚合杂交后代F1分离，每个F1自交，收获F1自交株45个。种植F2代株系45个，出现稳定株系45个，稳定株系出现比列100%，诱导率100%。
[0036]用3380做父本与甘蓝型油菜3968去雄聚合杂交(3968为F1，由中双11与1365杂交而来)，聚合杂交后代F1分离，每个F1自交，收获F1自交株52个。种植F2代株系52个，出现稳定株系28个，稳定株系出现比例53.85%，诱导率53.85%。[0037]同样用3380做父本与甘蓝型油菜中双11 (常规品种，纯合系)去雄杂交，获得杂交F1植株70株，70株F1形态与中双11完全相同，且每个单株自交后F2代未发生分离，为稳定株系，与中双11形态也完全相同，说明F1代就为纯系。即3380与中双11杂交过程，诱导中双11发生了孤雌生殖，所产生的F1为孤雌生殖自交，是纯合系，因此F1稳定、F2也稳定，且与中双11形态完全相同，该诱导率100%。
[0038]最终，显性矮杆八倍体植株3380确定为甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系。
[0039]附表1 MS培养基成分配`方`
【权利要求】
1.甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法，该方法包括以下步骤: 1)选育具有孤雌生殖遗传特性的四倍体早代稳定系: (I)将两个亲本材料杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍获得加倍后的F1代植株； (2 )加倍后的F1代植株进行自交或强制自交获得F2代，对F2代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择四倍体可育后代自交获得F3代，对F3代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系-四倍体早代稳定系； (3)获得的四倍体早代稳定系与至少10个四倍体常规纯合稳定系进行正反交，F1代、F2代鉴定早代稳定系的遗传特性，即是否有孤雌生殖特性；上述正反交，如有F1分离，F2代出现部分稳定株系，对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的四倍体早代稳定系； 2)选育携带显性遗传性状且具有孤雌遗传特性的八倍体油菜； (1)具有孤雌生殖遗传特性的四倍体早代稳定系与具有显性性状四倍体油菜杂交(如显性矮杆、紫叶、花叶、黄叶等性状)，得到杂交F1代种子；上述杂交F1种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显性性状的F1值株； (2)对加倍的带显性性状的F1植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的八倍体的植株 ，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加倍植株； 3)甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系鉴定及选育:选择带显性性状的上述八倍体植株与质不育或核不育的纯合不育系单株测交，并对测交后代进行形态鉴定及育性鉴定: (1)八倍体植株中的显性性状能去除测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株、或非四倍体植株，说明该植株是八倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株; (2)上述单株测交后代如果出现全不育、为正常四倍体油菜、且不带显性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性八倍体植株为甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系。
2.如权利要求1所述的甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法，其特征在于将两个亲本材料杂交F1代种子或具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍的具体方法如下: 1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25—40秒，用0.1%升汞消毒12 —17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基上； 2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件:温度23—25°C，白天光照12—16小时，光照强度2000— 3000勒克斯，夜晚暗培养8 —12小时，待植株长到I一2片真叶时，从下胚轴处剪下植株继续在第二培养基上生长； 3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基中进行生根培养；4)生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3— 7天，取出植株将植株上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15 — 30分钟后移栽到温室中，温室温度16°C — 25°C，相对湿度60— 80%，能保证移栽成活率在95%以上； 上述的第一培养基由以下配比的组分组成: MS培养基1L 6—苄基腺嘌呤0.5— 1.5mg 染色体加倍诱导剂30— 70mg 蔗糖20— 30g 琼脂8 一IOg, 第一培养基的pH=5.8—6.0， 上述的第二培养基由以下配比的组分组成: MS培养基1L 6—苄基腺嘌呤0.5 — Img 染色体加倍诱导剂20— 40mg 蔗糖20— 30g 琼脂8 一IOg, 第二培养基的pH=5.8—6.0， 上述的第三培养基由以下配比的组分组成: MS培养基1L α—蔡乙酸0.03—0.5mg 染色体加倍诱导剂5 — 20mg 蔗糖20— 30g 琼脂8 一IOg, 第三培养基的pH=5.8—6.0， 上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成:水1L 易保或克露0.6—1.2g α一萘乙酸0.5—Img 。
3.如权利要求1或2所述的甘蓝型油菜纯合四倍体诱导系的选育方法，其特征在于染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。
【文档编号】A01H4/00GK103858753SQ201410151678
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】付绍红, 张汝全, 杨进, 李云, 王继胜, 邹琼, 陶兰蓉, 康泽明, 唐蓉 申请人:成都市农林科学院