一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法
【专利摘要】一种取材便利、成本低、重复性好以及无畸形芽的利用大白菜球叶叶片获得再生植株的方法。其特征包括以下步骤：(1)选取结球期大白菜外部球叶，在无菌条件下消毒灭菌。(2)将灭菌后的叶片正面向上平置于芽诱导培养基上进行培养。(3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，转入MS基本培养基中继续培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽切下，转入生根培养基诱导生根。(4)再生芽基部形成大量毛根后，将再生苗根部的生根培养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。本方法直接从田间生长植株取材，不需要经过种子萌发过程，对及时保存优良珍贵大白菜材料意义重大，同时为大白菜转基因育种研究提供稳定的受体新材料。
【专利说明】一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大白菜组织培养【技术领域】，特别涉及一种取材便利、成本低、重复性好 以及无畸形芽的利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法。
【背景技术】
[0002] 大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis (Lour) Olsson)是我国栽培面 积最大的十字花科芸薹属植物，在全国蔬菜生产和消费中一直处于重要地位。目前生物技 术在提高大白菜育种效率中的作用日益凸显。组织培养作为最重要的生物技术手段之一， 对大白菜种质材料的保存和快繁，以及在基因工程育种中获得大量稳定的转基因植株具有 重要意义。大白菜属于芸薹属AA基因组，携带有抑制芽再生的基因，较属内其他基因组型 离体再生难度大。不同品种之间再生频率也存在较大差异。
[0003] 此外，大白菜的商品性状往往在结球后期才能充分的表现，对田间材料的综合性 状调查也主要集中于该时期。若能在此时对发现的优良材料进行及时保存与扩繁，则能提 前对优良大白菜材料展开育种利用。而目前的再生方法往往无法及时保存珍贵优良的种质 材料，并且对于转基因获得成功的材料不能及时扩繁，无法为后续的研究提供大量研究材 料，制约了大白菜生物技术育种的发展。
[0004] 前人采用子叶、子叶柄-子叶、下胚轴、花器官（Pernell等，2002 ;孙宝娟等，2005) 等外植体通过诱导不定芽获得大白菜再生植株；采用小孢子、花药、原生质体培养通过诱导 胚获得再生植株。在目前建立的再生体系中最常用的外植体为子叶柄-子叶，在此基础上， 不同研究者以保留不同比例子叶的子叶柄-子叶外植体进行再生，研究结果差异较大。而 子叶柄-子叶外植体只能一次性取材，每次获得的外植体数量有限。
[0005] 大白菜真叶再生国内外研究较少。成细华等（2001)首先利用苗龄为3周的无菌 苗顶部第2-3片嫩叶为外植体，切割为2-4mm见方，通过诱导愈伤组织获得不定芽。在刘学 成等（2011)的研究中，当大白菜无菌苗长出第2片真叶时，以第1片真叶的叶柄插入培养 基，从叶柄基部诱导获得不定芽；而将真叶片切割为5_见方，平铺在诱导培养基上则无不 定芽分化。目前尚未见利用成株大白菜结球叶片进行植株再生的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种取材便利、成本低、重复性好以及无畸形芽的利用大白 菜球叶叶片获得再生植株的方法。省去以往大白菜组织培养过程中的无菌苗培养环节，使 田间发现的优良植株及搜集的珍贵材料能够得到及时保存和扩繁，并为大白菜基因工程研 究提供新的受:体。
[0007] 本发明的技术方案是：一种利用大白菜球叶获得再生植株的方法，其特征在于包 括以下步骤：
[0008] 1)选取结球期大白菜外部球叶，去掉叶柄。在无菌条件下，先用体积分数70%的 酒精表面消毒30s，无菌水漂洗一遍。再倒入质量分数5%的NaCIO溶液灭菌lOmin，无菌水 轻轻漂洗15min，期间换水5-6次。消毒完毕，用灭菌吸水纸将叶片残留水分吸干。
[0009] 2)将灭菌后的叶片切分为边长1. 5-2. 0cm的叶块，避开较粗叶脉，叶正面向上平 置于芽诱导培养基上。在光照强度1500-2000Lux，光周期16h/d，温度24±1°C条件下进行 培养。
[0010] 3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，之后转入MS基本培养基（表2)中继续 培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽切下，转入生根培养基诱导生根。以上培 养条件均为：光照强度1500-2000LUX，光周期16h/d，温度24土 1°C。
[0011] 4)再生芽基部形成大量毛根后，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再生苗根部的生根培 养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。基质采用蛭石和草炭体积比1 : 1混合而成。 盆口用保鲜薄膜覆盖保湿。3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔数逐渐增加，孔隙逐渐 加大。覆膜培养l〇d后，揭去保鲜薄膜，将再生植株置于室温下培养。基质栽培过程中，均 给予自然光照。
[0012] 步骤 2)中所述的芽诱导培养基为 MS+4mg/L6-BA+lmg/LNAA+4mg/LAgN03+30g/L 鹿 糖+0.711^/1琼脂，？!1为5.8。
[0013] 步骤3)中所述的生根培养基为MS+0. 5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0· 7mg/L琼脂，pH为 5. 8〇
[0014] 本发明的有益效果是：本发明以大白菜球叶叶片为外植体，对诱导培养基中6-BA 与NAA浓度配比进行了优化。较传统大白菜组织培养过程简化，省去了无菌苗培养环节，节 省了时间。培养过程简单，外植体在添加激素的诱导培养基培养28d后，可直接放到无任何 激素的MS基本培养基上继续诱导不定芽，节省了激素用量，降低了组织培养成本。取材便 利，外植体制备量大，对及时保存珍贵材料具有重要应用价值。同时本发明为大白菜转基因 育种提供新的转化受体，也为转基因植株的迅速扩繁提供高效的再生途径，具有广泛的应 用前景。
[0015] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为'新北京三号'大白菜消毒后的球叶叶片接种于芽诱导培养基图片；
[0017] 图2为'新北京三号'大白菜叶片在芽诱导培养基中培养7d的图片，叶片边缘膨 大，形成不定根；
[0018] 图3为'新北京三号'大白菜叶片在芽诱导培养基中培养14d的图片，萌发不定根 的叶缘处形成愈伤组织；
[0019] 图4为'新北京三号'大白菜叶片在芽诱导培养基中培养14d的图片（底部），不 定根基部形成较大愈伤团；
[0020] 图5为'新北京三号'大白菜叶片在芽诱导培养基中培养22d的图片，由叶缘愈伤 组织处诱导形成若干不定芽；
[0021] 图6为'新北京三号'大白菜叶片在MS基本培养基中培养15d的图片，不定芽叶 片伸长，增大；
[0022] 图7为'新北京三号'大白菜叶片再生芽在生根培养基中培养10d的图片；
[0023] 图8为'城阳青'大白菜叶片再生芽在生根培养基中培养15d的图片；
[0024] 图9为'新北京三号'大白菜球叶再生植株转移到栽培基质中培养lOd后的图片；
[0025] 图10为'城阳青'大白菜球叶再生植株转移到栽培基质中培养10d后的图片。
【具体实施方式】
[0026] -种利用大白菜球叶获得再生植株的方法，包括以下步骤：
[0027] 1)选取结球期大白菜外部球叶，去掉叶柄。在无菌条件下，先用体积分数70%的 酒精表面消毒30s，无菌水漂洗一遍。再倒入质量分数5%的NaCIO溶液灭菌lOmin，无菌水 轻轻漂洗15min，期间换水5-6次。消毒完毕，用灭菌吸水纸将叶片残留水分吸干。
[0028] 2)将灭菌后的叶片切分为边长1. 5-2. 0cm的叶块，避开较粗叶脉，叶正面向上平 置于芽诱导培养基上。在光照强度1500-2000Lux，光周期16h/d，温度24±1°C条件下进行 培养。
[0029] 3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，之后转入MS基本培养基（表2)中继续 培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽切下，转入生根培养基诱导生根。以上培 养条件均为：光照强度1500-2000LUX，光周期16h/d，温度24±1°C。
[0030] 4)再生芽基部形成大量毛根后，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再生苗根部的生根培 养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。基质采用蛭石和草炭体积比1 : 1混合而成。 盆口用保鲜薄膜覆盖保湿。3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔数逐渐增加，孔隙逐渐 加大。覆膜培养l〇d后，揭去保鲜薄膜，将再生植株置于室温下培养。基质栽培过程中，均 给予自然光照。
[0031] 步骤2)中所述的芽诱导培养基为MS+4mg/L6_BA+lmg/L NAA+4mg/LAgN03+30g/L鹿 糖+0.711^/1琼脂，？!1为5.8。
[0032] 步骤3)中所述的生根培养基为MS+0. 5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0· 7mg/L琼脂，pH为 5. 8〇
[0033] 实验 1 :
[0034] 1)选取结球期大白菜'新北京三号'和'城阳青'两个品种的外部球叶，去掉叶柄。 在无菌条件下，先用体积分数70%的酒精表面消毒30s，无菌水漂洗一遍。再倒入质量分数 5%的NaCIO溶液灭菌10min，无菌水轻轻漂洗15min，期间换水5-6次。消毒完毕，用灭菌 吸水纸将叶片残留水分吸干。
[0035] 2)将灭菌后的叶片切分为边长1. 5-2. 0cm的叶块，避开较粗叶脉。叶正面向上 平置于不同6-BA/NAA配比（表1)，附加4mg/L AgN03的芽诱导培养基上。在光照强度 1500-2000Lux，光周期16h/d，温度24± 1°C条件下进行培养。每个处理30-35个外植体，重 复三次。4周后统计不定芽再生情况。
[0036] 表1不同6-BA与NAA浓度配比对大白菜不定芽再生的影响
[0037]
【权利要求】
1. 一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法，其特征在于包括下列步骤： (1) 选取结球期大白菜外部球叶，去掉叶柄，在无菌条件下，先用体积分数70%的酒精 表面消毒30s，无菌水漂洗一遍，再倒入质量分数5%的NaCIO溶液灭菌lOmin，无菌水轻轻 漂洗15min，期间换水5-6次，消毒完毕，然后用灭菌吸水纸将叶片残留水分吸干； (2) 将灭菌后的叶片切分为边长1. 5-2. 0cm的叶块，避开较粗叶脉，叶正面向上平置于 芽诱导培养基上。在光照强度1500-2000Lux，光周期16h/d，温度24± 1°C条件下进行培养； (3) 外植体在芽诱导培养基中培养28d，之后转入MS基本培养基中继续培养，将外植体 上长度大于1. 5cm的再生不定芽切下，转入生根培养基诱导生根，以上培养条件均为：光照 强度 1500-2000Lux，光周期 16h/d，温度 24±1°C ; (4) 再生芽基部形成大量毛根后，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再生苗根部的生根培养 基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中，基质采用蛭石和草炭体积比1 : 1混合而成，盆 口用保鲜薄膜覆盖保湿，3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔数逐渐增加，孔隙逐渐加 大，覆膜培养l〇d后，揭去保鲜薄膜，将再生植株置于室温下培养，基质栽培过程中，均给予 自然光照。
2. 如权利要求1所述的利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法，其特征在于所述 步骤⑵中的芽诱导培养基由MS、6-BA、NAA、AgN0 3、蔗糖和琼脂组成，其中每升MS中加入 6_BA4mg、NAAlmg、AgN034mg、鹿糖 30g、琼脂 0· 7mg，pH 为 5. 8。
3. 如权利要求1所述的利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法，其特征在于所述步 骤（3)中的MS基本培养基为不添加激素的常规MS培养基。
4. 如权利要求1所述的利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法，其特征在于所述步 骤（3)中的生根培养基由MS、NAA、蔗糖和琼脂组成，其中，每升MS中加入NAAO. 5mg、蔗糖 3(^以及琼脂0.711^，？!1为5.8。
【文档编号】A01H4/00GK104115751SQ201410364506
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】刘倩倩, 刘维信 申请人:青岛农业大学