苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa及其编码基因和应用。该苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，编码基因的碱基序列如SEQ?ID?No.2所示。所述应用是苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白在制备杀虫剂中的应用，以及编码基因在培育抗虫转基因植物中的应用。与现有技术相比，本发明以Vip3D基因和Vip3Aa1基因为蓝本，设计并合成嵌合基因Vip3DAa，嵌合基因Vip3DAa表达获得的Vip3DAa蛋白对鳞翅目昆虫、蚜虫具有较高的杀虫活性；嵌合基因Vip3DAa能在棉花、玉米、油菜和大豆等植物细胞中高效表达，可用于培育抗虫转基因植物。
【专利说明】苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa及其编码基因和 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物防治【技术领域】，具体涉及苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白 Vip3DAa及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 农作物病虫害是我国的主要农业灾害之一，它具有种类多、影响大、并时常暴发成 灾的特点，其发生范围和严重程度对我国国民经济、特别是农业生产常造成重大损失。据统 计，我国每年因病虫害损失粮食近500亿斤、各类经济作物1800万吨。过去为了防治作物 的各种虫害，化学农药被广泛使用，然而，一方面由于长期大量使用农药，导致部分昆虫产 生了一定的耐药性或抗性，致使农药的使用剂量在逐年增加或使用全新的农药；另一方面， 由于长期过度使用化学农药，导致人类赖以生存的环境受到不同程度污染。因此，需要寻找 更好的途径防控各种病虫害。随着生物技术的发展，利用抗虫基因培育抗虫转基因植物是 一条行之有效的途径。
[0003] 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt)是植物外源抗虫基因的重 要供体菌，其毒性活性主要源自芽胞形成时所产生的伴孢晶体毒素，即杀虫晶体蛋白 (insecticidal crystalline protein, ICP),包括晶体毒素 （crystalline toxin, Cry)和 细胞裂解毒素 （cytolytic toxin，Cyt)。ICP是由Cry基因和Cyt基因编码的，对敏感昆虫 有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。
[0004] 已报道的杀虫晶体蛋白基因有748种，很多已广泛应用于抗虫转基因育种中。然 而，由于大部分商业化利用的转基因作物均为杀虫晶体蛋白类，随着这些转基因作物种植 面积的扩大，害虫对单一的杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。因此寻找新的抗虫 基因显得尤为重要。
[0005] 科学家经过不懈的努力，从一些营养生长时期的Bt菌株中分离得到具有杀虫毒 性的非伴孢晶体杀虫蛋白，合成后即被分泌到胞外，这就是被称为第二代抗虫蛋白的苏云 金芽胞杆菌的营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal protein jiphVips主要分为 Vipl、Vip2、Vip3和Vip4四种类型共108个杀虫蛋白，其中77个蛋白属于Vip3。Vip3的 杀虫谱和杀虫活性与ICPs不同，前者对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等害虫具有毒杀作用，且 抗虫谱更广。目前，这些基因被广泛应用于抗虫转基因水稻、玉米和棉花育种。
[0006] 然而，Vip3基因的资源毕竟是有限的，而且不同的基因间的抗性存在比较大的差 异，同时细菌的基因是富含AT的，这势必影响基因在植物中的表达，对相应基因进行人工 改造，可以进一步提商基因的利用效率。
[0007] 文献（Fang et al. , Characterization of chimeric Bacillus thuringiensis Vip3toxins, Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73 (3) :956-961 ;方军，苏 云金杆菌营养期杀虫蛋白Vip3基因及其在转基因水稻中的应用，2008,博士论文，浙江大 学图书馆）通过将Vip3Ab2的N端或C端与Vip3Aal的C端或N端嵌合，人工合成Vip3AbAa 和Vip3AaAb，结果表明，嵌合基因的杀虫谱更广，而且对部分昆虫的杀虫活性更高。因此，通 过人工合成嵌合基因是改造 Vip3基因的有效途径。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa，该苏云金芽孢杆菌 营养期杀虫蛋白能在植物细胞中高效表达，对鳞翅目昆虫具有较高的杀虫活性。
[0009] -种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)营养期杀虫蛋白Vip3DAa，其氨 基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0010] 本发明还提供了所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa的编码基因，其碱 基序列如SEQ ID No. 2所示。该编码基因是通过以下思路设计并合成的：
[0011] (1)获取 Vip3D 基因 （GenBank Accession No :DQ〇54848)中编码 Vip3D 蛋白 N 端 257个氨基酸的771个碱基序列；
[0012] (2)获取 Vip3Aal 基因 （GenBank Accession No :L48811)中编码 Vip3Aal 蛋白 C 端532个氨基酸的1596个碱基序列；
[0013] (3)嵌合步骤（1)和（2)获得的两个碱基序列，获得一个初步改造的原始碱基序 列；
[0014] (4)排除所述原始碱基序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含 AT的序列以及常用的限制性内切酶位点，在不改变氨基酸序列的前提下进行密码子置换， 获取改进后的碱基序列；
[0015] (5)将改进后的碱基序列的正链和对应的负链进行BLAST2分析，在不改变氨基酸 序列的前提下进行密码子置换，排除序列中存在的反向重复序列；最终获得如SEQ ID No. 2 所不的喊基序列。
[0016] 步骤（4)和（5)中的密码子置换，是采用植物基因组的主要偏爱密码子置换所述 原始碱基序列或改正后的碱基序列中对应的密码子，以提高所述编码基因在目标植物中的 表达效率。
[0017] 本发明中，所述植物基因组的主要偏爱密码子为单子叶植物水稻（刘庆 坡，水稻的密码子用法及起始和终止密码子侧翼序列对基因表达的影响，2005,博 士学位论文，浙江大学图书馆）和双子叶植物拟南介（Duret L. and Mouchiroud D. Expression pattern and, surprisingly,gene length shape codon usage in Caenorhabditis, Drosophila, and Arabidopsis. 1999. PNAS. 96:4482-4487.)的核基因组 均偏好的密码子。
[0018] 将获得的SEQ ID No. 2所示的碱基序列重组到大肠杆菌等宿主细胞中表达，即获 得具有SEQID No. 1所示氨基酸序列的苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa。
[0019] 所述编码基因的G+C含量为59. 32 %，与现有的Vip3基因的最高同源性为 88. 64% ;而所述原始碱基序列的G+C含量仅为30. 84%，两者的同源性仅为68. 55%。
[0020] 所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa与现有的Vip3蛋白即Vip3Aal蛋 白的最高同源性为96. 3%，与Vip3D蛋白的同源性92. 5%。
[0021] 本发明还提供了含有所述编码基因的表达单元、表达载体或转化子。作为优选，所 述表达单元的启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下， Vip3Da蛋白可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。所述表达载体的原始载体 可选用 pET28a(+)。
[0022] 本发明还提供了所述编码基因在培育抗虫转基因植物中的应用，包括：
[0023] (1)构建含有所述编码基因的植物表达载体；
[0024] (2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化植物愈伤组织；
[0025] (3)将植物愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗后，移栽至大 田，筛选获得抗虫转基因植物。
[0026] 由于在设计所述编码基因时，是采用单子叶模式植物水稻和双子叶模式植物拟南 介核基因组的共同偏好密码子进行密码子置换，因此该编码基因适合单子叶植物和双子叶 植物，用于培育相应抗虫转基因植物。作为优选，所述抗虫转基因植物为抗虫转基因棉花、 玉米、油菜或大豆。
[0027] 本发明还提供了所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa在制备杀虫剂中 的应用。所述杀虫剂的杀灭对象优选为鳞翅目昆虫。所述鳞翅目昆虫如斜纹夜蛾、菜青虫、 棉铃虫、小地老虎和玉米螟等，更优选为斜纹夜蛾。所述杀虫剂的杀灭对象更优选为蚜虫。
[0028] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0029] 本发明以Vip3D基因和Vip3Aal基因为蓝本，设计并合成嵌合基因 Vip3DAa，嵌合 基因 Vip3DAa表达获得的Vip3DAa蛋白对鳞翅目昆虫、蚜虫具有较高的杀虫活性；嵌合基因 Vip3DAa能在棉花、玉米、油菜和大豆等植物细胞中高效表达，可用于培育相应的抗虫转基 因植物。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为Vip3Aal、Vip3D和Vip3DAa蛋白质的氨基酸序列比对图；
[0031] 图2A为转基因棉花对草甘膦的抗性结果图；
[0032] 图2B为非转基因棉花对草甘膦的抗性结果图；
[0033] 图3A为非转基因棉花对蚜虫的抗性结果图；
[0034] 图3B为转基因棉花对蚜虫的抗性结果图。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在Ausubel编 写的由 John WTle y and Sons 公司出版的 Current Pro tocols in Molecular Biology和 J.Sambrook等编写的由 Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Mannual, 3rd ED.等文献均有详细的说明。以下实施例中所用的实 验材料如无特殊说明均为市售购买产品。
[0036] 实施例1嵌合基因的设计和合成
[0037] 以Vip3D基因和Vip3Aal基因为蓝本，设计嵌合基因 Vip3DAa，具体步骤如下：
[0038] (1)获取 Vip：3D 基因 （GenBank Accession No :DQ〇54848)中编码 Vip：3D 蛋白 N 端 257个氨基酸的771个碱基序列；
[0039] (2)获取 Vip3Aal 基因 （GenBank Accession No :L48811)中编码 Vip3Aal 蛋白 C 端532个氨基酸的1596个碱基序列；
[0040] (3)嵌合步骤（1)和（2)获得的两个碱基序列，获得一个初步改造的原始碱基序 列，如SEQ ID No. 3所示，该序列的G+C含量仅为30. 84% ;
[0041] (4)在不改变氨基酸序列的前提下，将所述原始碱基序列中存在的典型的造成 植物基因转录本不稳定的富含AT的序列以及常用的限制性内切酶位点置换为单子叶植 物水稻（刘庆坡，水稻的密码子用法及起始和终止密码子侧翼序列对基因表达的影响， 2005,博士学位论文，浙江大学图书馆）和双子叶植物拟南介（Duret L. and Mouchiroud D. Expression pattern and, surprisingly,gene length shape codon usage in Caenorhabditis，Drosophila，and Arabidopsis. 1999.PNAS. 96:4482-4487.)核基因组均 偏好的密码子，获得改进后的碱基序列；
[0042] (5)将改进后的碱基序列的正链和对应的负链进行BLAST2分析，在不改变氨基酸 序列的前提下，将序列中存在的反向重复序列置换为单子叶植物水稻和双子叶植物拟南介 核基因组均偏好的密码子，获得最终的嵌合基因 Vip3DAa，如SEQ ID No. 1所示，该序列与 SEQ ID No. 3所示的序列同源性仅有68. 55%。SEQ ID No. 1所示的序列及含有该DNA片段 的质粒roC-Vip3DAa均委托生工生物工程（上海）有限公司完成。
[0043] 实施例2嵌合基因的表达
[0044] 利用实施例1获得的Vip3DAa嵌合基因表达云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白 Vip3DAa，具体包括：
[0045] 将Vip3DAa嵌合基因构建到大肠杆菌质粒表达载体pET28a(+)上，并转化大肠杆 菌表达宿主BL21(DE3);接种单菌落于5毫升LB培养基中，37°C培养过夜，再按1 :100比例 进行稀释培养至〇D_为0. 4-0. 6,而后加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导表达，诱导时间 为4-6小时；离心收集菌体，加入20mL无菌水重悬，液氮反复冻融6次，离心去菌体，获取上 清液。
[0046] Vip3DAa蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。将Vip3DAa蛋白的氨基酸序列 分别与Vip3Aal蛋白和Vip3D蛋白进行Blast2比对，在蛋白质水平的同源性分别为96. 3 % 和92. 5% (见图1)。
[0047] 实施例3 Vip3DAa蛋白的杀虫活性
[0048] 将实施例2获得的上清液喂养鳞翅目昆虫斜纹夜蛾，并以清水、转化有pET28a(+) 空载体的大肠杆菌的发酵上清液为对照，检测Vip3DAa蛋白对斜纹夜蛾的杀虫活性，结果 见表1。
[0049] 表1三种样品对斜纹夜蛾的杀虫活性比较
[0050]
【权利要求】
1. 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)营养期杀虫蛋白Vip3DAa，其特征在 于，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 如权利要求1所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa的编码基因，其特征在 于，碱基序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 含有如权利要求2所述编码基因的表达单元。
4. 如权利要求3所述的表达单元，其特征在于，启动子为T7启动子、lac启动子或 araBAD启动子。
5. 含有如权利要求2所述编码基因的表达载体。
6. 含有如权利要求2所述编码基因的转化子。
7. 如权利要求2所述编码基因在培育抗虫转基因植物中的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗虫转基因植物为抗虫转基因棉花、玉 米、油菜或大豆。
9. 如权利要求1所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3DAa在制备杀虫剂中的应 用。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述杀虫剂的杀灭对象为蚜虫。
【文档编号】A01N47/44GK104151408SQ201410391800
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】潘刚, 毛节景, 龚盼, 程方民 申请人:浙江大学