一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养及条件的优化等步骤，本发明方法所制备的苦石莲悬浮细胞增殖系数高，生长周期短，次生代谢物含量高，为苦石莲药用成分的开发和利用提供新的途径。
【专利说明】 一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及苦石莲悬浮细胞培养的快繁方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]苦石莲，Caesalpinia minax又称为石莲子、老鸦枕头、土石莲子,豆科,有刺藤本，全株被短柔毛。2回双数羽状复叶，羽片5?8对，托叶锥状；小叶12?24枚，近无柄，矩形或倒卵形，长约1.6?3.5厘米，阔0.8?1.2厘米，先端急尖成细尖，基部圆形，全缘。分布广东、广西、四川、云南等地。药材主产云南、广西。此外，广东、四川、江西、福建等地亦产，生于山沟中空旷的溪旁、路边或灌木丛中。主产云南、广西。此外，广东、四川、江西、福建等地亦产，该植物的根、苗亦供药用性苦寒，有散瘀，止痛，清热，去湿的功效，目前主要是野外采集。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供石莲悬浮细胞增殖系数高，生长周期短，次生代谢物含量高，为苦石莲药用成分的开发和利用提供新的途径。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min，超净工作台上0.1%氯化汞处理lOmin，无菌水冲洗7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，ΙΟΟΟΙχ，温度23°C，湿度50%，诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇3_5ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度23°C，湿度50%，取生长良好，长势均一的愈伤组织，称取 0.3g 加入 ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+ 对氨基苯甲酸 80-100mg/L+0.35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分。
[0005]采用本发明制备的苦石莲悬浮细胞长势好，生长周期短，次生代谢物含量高。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min，超净工作台上0.1%氯化汞处理lOmin，无菌水冲洗7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼月旨，30g/L葡萄糖，100lx,温度23°C，湿度50%，诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇4ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度23°C，湿度50%，取生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+对氨基苯甲酸90mg/L+(X 35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，增长率47%。
[0008]实施例2
取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min，超净工作台上0.1%氯化汞处理lOmin，无菌水冲洗7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，ΙΟΟΟΙχ，温度23°C，湿度50%，诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇3ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度23°C，湿度50%，取生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+对氨基苯甲酸80mg/L+(X 35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，增长率45%。
[0009]实施例3
取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min，超净工作台上0.1%氯化汞处理lOmin，无菌水冲洗7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，ΙΟΟΟΙχ，温度23°C，湿度50%，诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇5ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度23°C，湿度50%，取生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+对氨基苯甲酸100mg/L+0.35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，增长率42%。
【权利要求】
1.一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养及条件的优化，其主要步骤如下: (I)取苦石莲幼嫩的叶片，在超净工作台上对其进行消毒处理； (2 )取步骤(I)消毒处理过的叶片接入 ER+NAA0.05mg/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.25mg/L+2, 4-D1.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，ΙΟΟΟΙχ，温度23。。，湿度 50% ； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织，接入ER+NAA2.0mg/L+6-BA3.0mg/L +2，4-D3.0mg/L+NAA2.0mg/L+巯基乙醇3_5ml/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加7g/L琼脂，30g/L葡萄糖，20001x，温度 23。。，湿度 50% ； (4)取步骤(3)生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0.3g加入ER+2，4-D3.0mg/L+KT0.lmg/L+对氨基苯甲酸80-100mg/L+0.35%琼脂+20g/L葡萄糖培养基中震荡培养，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分。
2.按照权利要求1所述的一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述苦石莲无菌叶片的获得为，取苦石莲幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡5min，流水冲洗25min,超净工作台上0.1%氯化萊处理1min,无菌水冲洗7遍,吸水纸吸去表面水分。
3.按照权利要求1所述的一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(3)增殖培养基中附加了吸附剂巯基乙醇，可以消除生长过程中褐化现象的出现。
4.按照权利要求1所述的一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)悬浮细胞培养中附加了对氨基苯甲酸，对细胞生长量和次生代谢物质的含量均有显著的影响。
5.按照权利要求1所述的一种苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(3)悬浮细胞培养采用水平震荡培养，震荡速度90r/min，每60ml细胞悬浮液装入150ml三角瓶中培养，温度26°C，光照20001x。
【文档编号】A01H4/00GK104255467SQ201410463128
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司