一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法
【专利摘要】一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其操作步骤包括：采集目标烟草烟碱转化株上处于单核靠边发育时期的花蕾，先用酒精对剥离出的花药进行短时间消毒，然后浸入饱和次氯酸钙溶液中进行消毒处理，无菌水冲洗后迅速转移到H培养基上进行培养，维持室内温度和光照，待烟苗长到5-6片真叶时转移到秋水仙素中浸泡进行染色体加倍，在无菌水浸泡清洗后转植到MS培养基上继续生长，流式细胞仪鉴定染色体倍性为双单倍体的烟苗在移栽季节经炼苗后进行移栽，套袋自交留种，次年团棵期取样检测烟碱和降烟碱含量以计算烟碱转化率，其烟碱转化属性与原始材料一致的即为纯化成功的烟株。该方法特别适用于以减少烟草特有亚硝胺为目标的低烟碱转化率性状的提纯。
【专利说明】一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及烟草组织培养领域，特别涉及一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法。
【背景技术】
[0002] 降烟碱是烟草中的四种生物碱之一，正常情况下含量为3. 5%，极易在调制和陈化 等处理环节中发生亚硝化和酰化等生化反应而产生致癌物质-烟草特有亚硝胺（TSNAs)， 从而影响烟叶品质，损害烟草消费者身体健康，因此，降低烟草中降烟碱含量一直是国际烟 草减害研究领域的重点和热点。
[0003] 烟草（Nicotiana tabacum L, ·)是异源四倍体植物（2n=48)，目前的烟草基因组 计划研究结果表明，其基因组结构十分复杂，基因杂合度较高，拷贝数丰富，因此，控制性状 的基因位点的纯合度受到较大影响，在实际育种工作中表现为烟草品种使用一段年限后往 往出现性状分离、种性退化等不良现象。对于烟草转化性状的纯化或提纯，传统的方法是定 向选择和多代自交结合使用，栽培种烟草为一年生植物，根据基因自交纯合速度，在具备丰 富育种经验保证单株选择正确的前提下，一般也至少需要自交5-6代才能达到育种上可用 的遗传纯合度，即需要耗费5-6年时间，费时费力，严重影响了烟草减害品种的育种进程和 准确度。
【发明内容】
[0004] 本发明针对传统纯化方法的不足，提供一种快速纯化烟草烟碱转化株的可靠方 法，即采用花药培养结合染色体加倍技术，用流式细胞仪鉴定染色体倍性，大幅提高加倍效 率，次年后代团棵期性状鉴定，此技术只需1. 5代即1年半时间便可实现高度纯化烟草烟碱 转化株，相比传统自交纯化技术大大节省了时间和人力物力，而且后代性状高度稳定，较适 合于亲本和杂交后代的纯化处理，为优良烟碱转化品种选育提供了强大的技术支撑。
[0005] 本发明所称的烟碱转化率（%) =[降烟碱含量/ (烟碱含量+降烟碱含量）]，表示 烟碱转化能力的大小。
[0006] 本发明所称的烟碱转化株即具有烟碱向降烟碱转化能力的烟株。一般按烟碱转化 率大小对烟株进行烟碱转化属性分类： (1)非转化株：烟碱转化率低于5%的烟株。
[0007] (2)低转化株：烟碱转化率低于5%至20%的烟株。
[0008] (3)高转化率：烟碱转化率大于50%。
[0009] 所述一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征在于依次按以下操作步骤进 行： (1) 花蕾采集和保存：采集烟草植株主花序或侧花序上健康的适龄花蕾，用冰盒迅速密 封保存； (2) 消毒：在超净工作台上剥取步骤1花蕾中的花药，用无菌纱布或无菌市售丝袜包裹 花药并浸入70-75%浓度的酒精中消毒10-15 s，快速取出且立即浸入饱和Ca(ClO) 2溶液 中，轻轻晃动烧杯以使消毒充分，最后用无菌水冲洗多次； (3 )花药接种与培养：将清洗后的花药置于无菌的玻璃皿内，用消毒后的镊子轻取花药 接种到H培养基上，消毒、封口后置于培养架上培养，要求室内温度维持在25-27°C，每天光 照8-10 hr，利用电脑时控器来控制光照时间，用加湿器维持室内一定的湿度以免培养基失 水过快影响花药萌发； (4) 幼苗转植：将萌发且长到2-3叶期的幼苗转移到MS培养基上集中生长（150 ml的 三角瓶)，补充营养以快速生根长叶，每瓶放置5-6株幼苗，未萌发花粉继续在原H培养基上 培养，若发现培养基不够时则及时将幼苗转移到新的培养基上； (5) 幼苗加倍：将生长至5-6真叶期、高为1-2 cm左右的幼苗连根(大于此标准的苗子 则可用剪刀去根留茎)浸入到浓度为〇. 4-0. 5%的秋水仙素溶液中，48-72 hr后取出浸入无 菌水中3-5 min，不时晃动烧杯以清洗彻底，然后转植到MS培养基上，继续培养成苗； (6) 染色体倍性检测：用流式细胞仪鉴定烟苗的染色体倍性，检测为双单倍体的烟苗才 进行大田移栽，加倍未成功的烟苗重复以上的加倍处理步骤； (7) 烟苗移栽：待烟苗健壮且有8-9片真叶、10-12 cm高时，敞开瓶口炼苗3-5 d，然后 将烟苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直 接栽种于大田中； (8) 套袋留种：花期对烟株进行套袋以自交留种。
[0010] (9)纯化烟株鉴定：次年播种上年收获的种子，团棵期取样检测烟碱和降烟碱含量 以计算烟碱转化率，其烟碱转化属性与原始材料一致的即为纯化成功的烟株。
[0011] 所述方法还包括染色体倍性的检测步骤，其具体操作如下：从步骤5中获得的烟 株上采取小面积的无菌苗叶片放置在无菌试验台或是玻璃器皿中，向叶片滴加细胞裂解 液，之后，立即将其切碎，然后将切碎的叶片置于流式细胞仪中检测染色体倍性；或者从步 骤5中获得六片真叶以上的烟株上采取叶片，取叶片的下表皮并置于载玻片上，滴入一滴 1%碘一碘化钾溶液染色，盖上载玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的显微镜下观察 其染色体倍性。
[0012] 步骤1中所述的适龄花蕾指发育时期为单核靠边期即花萼与花冠等长的花蕾，其 蕾长范围在2. 0-2. 4 cm之间； 步骤2中饱和Ca (ClO) 2溶液浓度为10%，其消毒时间为8-10 min ;无菌水冲洗2-3次， 每次为3-5 min ; 步骤3中花药接种到H培养基上，温度维持在25-27°C，每天光照时间为8-10 hr ; 步骤5中用于染色体加倍的秋水仙素溶液浓度为0. 4-0. 5%，加倍处理时间为48-72 hr ； 步骤6中只有流式细胞仪鉴定其染色体倍性为双单倍体的烟苗才可在后续移栽中进 行大田移栽； 步骤9中其烟碱转化属性与原始材料一致的即为纯化成功的烟株。
[0013] 本发明所涉及的一种快速纯合烟草烟碱转化株的方法，具有构思新颖、设计巧妙、 科学实用、节约时间等特点，适用于所有烟草类型，特别适用于白肋烟低烟碱转化株的快速 纯化。在白肋烟低危害（TSNAs)新品种选育过程中，此方法可有效用于亲本和杂交后代的 快速纯化，比传统自己纯化方法大大节省了时间，减少了材料后代性状分离的比例，为减害 育种提供了一条新的有效途径，有较大的应用推广价值。
[0014] 附表说明（培养基配方均为公开配方） 表I :H和MS培养基母液配方； 表2 :H和MS培养基（1000 ml)。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为已知普通栽培种白肋烟流式细胞仪倍性检测图； 图2为单倍体流式细胞仪倍性检测图； 图3为双单倍体流式细胞仪倍性检测图； 图4为单倍体气孔叶绿体数检测示意图； 图5为双单倍体气孔叶绿体数检测示意图； 图6为多倍体气孔叶绿体数检测示意图。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1、白肋烟高烟碱转化株的纯化，具体步骤依次如下： (1) 花蕾采集和保存：于晴天采集已经鉴定为高烟碱转化株的白肋烟烟株侧花序上 无病虫、生长良好的、处于单核靠边期的花蕾，其外观表现为花萼与花冠大致等长，蕾长在 2. 0-2. 2 cm之间，取好的花蕾迅速用冰盒4-7 °C保存； (2) 消毒：在超净工作台上剥取步骤1花蕾中的花药，用无菌纱布包裹花药并浸入70% 浓度的酒精中消毒15 s，快速取出且立即浸入浓度为10%的饱和Ca(ClO) 2溶液中，消毒8 min，轻轻晃动烧杯以使消毒充分，最后用无菌水冲洗2次，每次5 min ; (3 )花药接种与培养：将清洗后的花药置于无菌的玻璃皿内，用消毒后的镊子轻取花药 接种到H培养基上，消毒、封口后置于培养架上培养，室内温度设置为25°C，光照时间设定 为10 hr,利用电脑时控器来控制光照时间，用加湿器维持室内一定的湿度以免培养基失水 过快影响花药萌发； (4) 幼苗转植：将萌发且长到3叶期的幼苗转移到MS培养基上集中生长（150 ml三角 瓶)，补充营养以快速生根长叶，每瓶放置5株幼苗，未萌发花粉继续在原H培养基上培养， 若发现培养基不够时则及时将幼苗转移到新的培养基上； (5) 幼苗加倍：将生长至5叶真叶期、高为2 cm左右的幼苗连根(大于此标准的苗子则 可用剪刀去根留茎）浸入到浓度为〇. 4%的秋水仙素溶液中，72 hr后取出浸入无菌水中4 min，不时晃动烧杯以清洗彻底，然后转植到MS培养基上，继续培养成苗； (6) 染色体倍性检测：取出步骤5中获得烟株的上层叶片，叶片面积大小为2 cmX2 cm左右，放入细胞裂解液后，立即用锋利的刀片切碎，然后将该混合液置于流式细胞仪 (BECKMAN，美国）中检测染色体倍性，上样后流式细胞仪自动生成代表该样品染色体倍性的 DNA含量分布图（如图2、3)。以已知普通栽培种白肋烟（图1)作为对照来调整流式细胞仪， 使对照样品DNA含量的波峰位于100道附近。然后测定待测样本的波峰，出现在50道和 100道附近的峰值分别代表单倍体和双单倍体，从而确定各烟苗的染色体倍性，只有染色 体倍性检测为双单倍体的烟苗才进行大田移栽，加倍未成功的烟苗重复以上的加倍处理步 骤； (7) 烟苗移栽：待烟苗健壮且有8-9片真叶、10-12 cm高时，敞开瓶口炼苗3-5 d，然后 将烟苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直 接栽种于大田中； (8) 套袋留种：花期对烟株进行套袋以自交留种。
[0017] (9)纯化烟株鉴定：次年播种上年收获的种子，团棵期取样检测烟碱和降烟碱含 量，计算烟碱转化率，其烟碱转化属性与原始材料一致的即为纯化成功的烟株。
[0018] 本实例中用于花药培养的白肋烟高烟碱转化材料其原始烟碱转化率为60. 5%，属 高烟碱转化材料，但由于遗传背景不纯，正常自交一代后分离比较严重。只从同一株烟株上 取花药进行培养和染色体加倍试验，收获种子后于次年播种，团棵期随机选取了 156株烟 株进行乙烯处理和取样检测，结果表明，有2株的烟碱转化率低于5%，属非转化株，比例为 1. 28%，由自然突变引起；有6株的烟碱转化率在5-20%之间，属低转化株，比例为3. 85%，由 不完全自然突变引起；其余148株的烟碱转化率高于50%，属高转化株，比例为94. 87%，高烟 碱转化株纯化成功，高烟碱转化特性得到了稳定遗传，这148株高转化株可用于基础理论 研究或者作为高转化特别资源保存。
[0019] 实施例2、白肋烟非烟碱转化株的纯化，具体步骤依次如下： (1) 花蕾采集和保存：于阴天采集已经鉴定为非烟碱转化株的白肋烟烟株主花序上 无病虫、生长良好的、处于单核靠边期的花蕾，其外观表现为花萼与花冠大致等长，蕾长在 2. 2-2. 4 cm之间，取好的花蕾迅速用冰盒4-7 °C保存； (2) 消毒：在超净工作台上剥取步骤1花蕾中的花药，用无菌市售丝袜包裹花药并浸入 75%浓度的酒精中消毒10 s，快速取出且立即浸入浓度为10%的饱和Ca(ClO) 2溶液中，消 毒10 min，轻轻晃动烧杯以使消毒充分，最后用无菌水冲洗3次，每次3 min ; (3) 花药接种与培养：将清洗后的花药置于无菌的玻璃皿内，用消毒后的镊子轻取花药 接种到H培养基上，消毒、封口后置于培养架上培养，室内温度设置为27°C，光照时间设定 为8 hr,利用电脑时控器来控制光照时间，用加湿器维持室内一定的湿度以免培养基失水 过快影响花药萌发； (4) 幼苗转植：将萌发且长到2叶期的幼苗转移到MS培养基上集中生长（150 ml三角 瓶)，补充营养以快速生根长叶，每瓶放置6株幼苗，未萌发花粉继续在原H培养基上培养， 若发现培养基不够时则及时将幼苗转移到新的培养基上； (5) 幼苗加倍：将生长至6叶真叶期、高为3 cm左右的幼苗连根(大于此标准的苗子则 可用剪刀去根留茎）浸入到浓度为〇. 5%的秋水仙素溶液中，48 hr后取出浸入无菌水中5 min，不时晃动烧杯以清洗彻底，然后转植到MS培养基上，继续培养成苗； (6) 染色体倍性检测：取步骤5中六片真叶以上的烟株叶片，用手小心地撕下叶片的下 表皮并置于载玻片上，滴一滴1 %碘一碘化钾溶液染色，盖上载玻片，制成切片，把制好的切 片放在40X的显微镜下，每切片随机选取5个气孔观察计数(如图4、5、6)，以每个气孔叶绿 体平均个数在14个以下的为单倍体(如图4)，14 一 24个的为双单倍体(如图5)，24个以上 的为多倍体(如图6)。只有染色体倍性检测为双单倍体的烟苗才进行大田移栽，加倍未成功 的烟苗重复以上的加倍处理步骤； (7) 烟苗移栽：待烟苗健壮且有8-9片真叶、10-12 cm高时，敞开瓶口炼苗3-5 d，然后 将烟苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直 接栽种于大田中； (8)套袋留种：花期对烟株进行套袋以自交留种。
[0020] (9)纯化烟株鉴定：次年播种上年收获的种子，团棵期取样检测烟碱和降烟碱含 量，计算烟碱转化率，其烟碱转化属性与原始材料一致的即为纯化成功的烟株。
[0021] 本实例中用于花药培养的白肋烟非烟碱转化材料其原始烟碱转化率为3. 5%，属 非烟碱转化材料，复杂的遗传背景导致自交后代烟碱转化性状严重分离。只选定一棵烟株 作为取样株以开展培养和染色体加倍试验。收获种子后于次年播种，团棵期随机选取了 149株烟株进行乙烯处理和取样检测，结果表明，有3株的烟碱转化率高于50%，属高转化 株，比例为2. 0%，由自然突变引起；有4株的烟碱转化率在5-20%之间，属低转化株，比例 为2. 68%，由不完全自然突变引起；其余142株的烟碱转化率低于5%，属非转化株，比例为 95. 3%，非烟碱转化株纯化成功，非烟碱转化特性得到了稳定遗传，这142株非转化株直接 可用于低烟碱转化白肋烟新品种选育或非转化资源保存。
[0022] 表I :H和MS培养基母液配方：
【权利要求】
1. 一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征在于依次按以下操作步骤进行： 步骤1 :花蕾采集和保存：采集烟草植株主花序或侧花序上健康的适龄花蕾，用冰盒迅 速密封保存； 步骤2 :消毒：在超净工作台上剥取步骤1花蕾中的花药，用无菌纱布或无菌市售丝袜 包裹花药并浸入70-75%浓度的酒精中消毒10-15 s，快速取出且立即浸入饱和Ca (CIO) 2溶 液中，轻轻晃动烧杯以使消毒充分，最后用无菌水冲洗多次； 步骤3 :花药接种与培养：将清洗后的花药置于无菌的玻璃皿内，用消毒后的镊子轻取 花药接种到Η培养基上，消毒、封口后置于培养架上培养，要求室内温度维持在25-27°C，每 天光照8-10 hr，利用电脑时控器来控制光照时间，用加湿器维持室内一定的湿度以免培养 基失水过快影响花药萌发； 步骤4 :幼苗转植：将萌发且长到2-3叶期的幼苗转移到MS培养基上集中生长（150 ml 三角瓶)，补充营养以快速生根长叶，每瓶放置5-6株幼苗，未萌发花粉继续在原Η培养基上 培养，若发现培养基不够时则及时将幼苗转移到新的培养基上； 步骤5 :幼苗加倍：将生长至5-6真叶期、高为1-2 cm左右的幼苗连根(大于此标准的 苗子则可用剪刀去根留茎)浸入到浓度为〇. 4-0. 5%的秋水仙素溶液中，48-72 hr后取出浸 入无菌水中3-5 min，不时晃动烧杯以清洗彻底，然后转植到MS培养基上，继续培养成苗； 步骤6 :染色体倍性检测：用流式细胞仪鉴定烟苗的染色体倍性，检测为双单倍体的烟 苗才可后续进行大田移栽，加倍未成功的幼苗重复以上的加倍处理步骤； 步骤7:烟苗移栽：待烟苗健壮且有8-9片真叶、10-12 cm高时，敞开瓶口炼苗3-5 d， 然后将烟苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季 节直接栽种于大田中； 步骤8 :套袋留种：花期对烟株进行套袋以自交留种； 步骤9 :纯化烟株鉴定：次年播种上年收获的种子，团棵期取样检测烟碱和降烟碱含量 以计算烟碱转化率，其烟碱转化属性与原始材料一致的即为纯化成功的烟株。
2. 根据权利要求1所述的一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征在于：所述方 法还包括染色体倍性的检测步骤，其具体操作如下：从步骤5中获得的烟株上采取小面积 的无菌苗叶片放置在无菌试验台或是玻璃器皿中，向叶片滴加细胞裂解液，之后，立即将其 切碎，然后将切碎的叶片置于流式细胞仪中检测染色体倍性；或者从步骤5中获得六片真 叶以上的烟株上采取叶片，取叶片的下表皮并置于载玻片上，滴入一滴1%碘一碘化钾溶液 染色，盖上载玻片，制成切片，把制好的切片放在40 X的显微镜下观察其染色体倍性。
3. 根据权利要求1所述的一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征是：步骤1 中所述的适龄花蕾指发育时期为单核靠边期即花萼与花冠等长的花蕾，其蕾长范围在 2·0 _2·4 cm 之间。
4. 根据权利要求1所述的一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征在于：步骤2 中饱和Ca (C10) 2溶液浓度为10%，其消毒时间为8-10 min ;无菌水冲洗2-3次，每次为3-5 min〇
5. 根据权利要求1所述的一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征在于：步骤3 中花药接种到Η培养基上，温度维持在25-27°C，每天光照时间为8-10 hr。
6. 根据权利要求1所述的一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征在于：步骤5 中用于染色体加倍的秋水仙素溶液浓度为0. 4-0. 5%，加倍处理时间为48-72 hr。
7. 根据权利要求1所述的一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征在于：步骤6 中只有流式细胞仪鉴定其染色体倍性为双单倍体的烟苗才可在后续移栽中进行大田移栽。
8. 根据权利要求1所述的一种快速纯化烟草烟碱转化株的方法，其特征在于：步骤9 中其烟碱转化属性与原始材料一致的即为纯化成功的烟株。
【文档编号】A01H4/00GK104285789SQ201410488974
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】蔡长春, 程玲, 冯吉, 余君 申请人:湖北省烟草科学研究院