一种蜡状芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明从福建省厦门市海沧、同安等港口淡海水交界处的水样及污泥样中分离并筛选得到具有很好生物防治作用的菌株，该菌株为蜡状芽孢杆菌菌株K2-1（ Bacilluscereus ），于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCGMCCNo:9547；并利用该蜡状芽孢杆菌菌株K2-1（ Bacilluscereus ）制备对水产养殖中多种病原菌均有较好的抑菌、防治效果的海洋源杀菌剂，且该海洋源杀菌剂使用过程对环境友好，无农药残留及污染问题，同时不存在对病原菌产生抗药性的特点，具有较好的生产应用前景。
CGMCC No.9547
2014.08.25
【专利说明】一种蜡状芽孢杆菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物菌株及其应用，尤其涉及一种蜡状芽孢杆菌菌株K2-1及应用其制备用于水产养殖中病害防治的杀菌剂。
【背景技术】
[0002]随着水产养殖的快速发展，尤其是高密度养殖，水产养殖病害的防治往往是决定经济收益的一个重要因素。如今养殖户的病害防治方法主要是通过使用抗生素进行防治，其效果虽好却也带来了抗生素残留的问题，且随着抗生素的使用，水产病原菌的抗药性亦随之增强，加之人们对饮食健康的重视，农业部出台相关政策使得抗生素在水产养殖上的应用将逐步被替代。
[0003]目前世界上普遍认为生物防治可能是解决水产养殖病害较为行之有效的途径之一，但国内外还暂未发现专门防水产养殖中各种病害的生物杀菌药剂，所以，本领域技术人员迫切需要有效防治水产养殖病害的新的微生物菌剂和方法的出现。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于提供一种蜡状芽孢杆菌菌株K2-1 {BacillusCerew1S),该腊状芽孢杆菌菌株K2-1于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCCNo:9547，且采用该菌株制备一种能够有效防治水产养殖病害的海洋源杀菌剂。
[0005]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:
本实验室从福建省厦门市海沧、同安等港口淡海水交界处的水样及污泥样中分离并筛选得到具有很好生物防治作用的菌株，并采用16s rDNA法对该菌株进行测序分析，最终鉴定其为蜡状芽孢杆菌的一个菌株。
[0006]进一步地，采用该菌株制备一种防治水产养殖中病害的海洋源杀菌剂，其制备的具体步骤为:
(1)所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1的活化:取所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1并将其接种至斜面SLB培养基，且于30-40°C下培养12-48h ;用接种环将斜面培养后的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基上，并于30-4(TC、150-200rpm条件下活化培养5_10h ；
(2)发酵液的制备:将步骤(I)活化好的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基中发酵培养接种量1_10%，搅拌速率150-200 rpm，温度设定为30_40°C ;发酵培养8_30h则获得所需的发酵液；
(3)取步骤(2)所得的发酵液进行8000-1OOOOrpm离心5-10min，之后将离心所得的上清液进行水浴，水浴温度70-80°C、水浴时间10-20min，得到不含菌体的发酵上清液，备用；
(4)发酵液色谱分离:将步骤(3)所得的发酵上清液进行柱层析分离，使用层析柱填充为S印hadex G-50,洗脱液为H2O,收集时间为40_90min，上样量为柱体积1°/Γ5%，流速0.5?lmL/min ； (5)杀菌剂成品:将步骤(4)收集到的收集液通过活性炭去色素，之后进行分装包装即可得所述海洋源杀菌剂的成品。
[0007]进一步地，所述LB培养基的组分均为:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 1g7H2O 1000mL ;所述SLB培养基的组分为:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，H2O 1000 mL。
[0008]本发明的有益效果在于:
提供一种蜡状芽孢杆菌菌株K2-1 {Bacillus cerem)，并利用该蜡状芽孢杆菌菌株K2-1 {Bacillus cereus)制备对水产养殖中多种病原菌均有较好的抑菌、防治效果的海洋源杀菌剂，且该海洋源杀菌剂使用过程对环境友好，无农药残留及污染问题，同时不存在对病原菌产生抗药性的特点，具有较好的生产应用前景。
【具体实施方式】
[0009]本发明一种蜡状芽孢杆菌菌株K2-1是从福建省厦门市海沧、同安等港口淡海水交界处的水样及污泥样中分离并筛选得到具有很好生物防治作用的菌株，并采用16s rDNA法对该菌株进行测序分析，最终鉴定其为蜡状芽孢杆菌的一个菌株。
[0010]1.菌株的分离:
(I)初筛:取1g海淡排污口出污泥样品，并加至10mL 0.85%NaCl中，搅拌后取上层浊液置于LB培养基，且于37°C、180rpm下富集培养，富集培养30h后，将菌液置于75°C水浴20min，水浴后的菌液进行梯度稀释及平板涂布法进行分离操作，之后挑取LB平板上长起的不同菌落形态的芽孢杆菌，保存备用。
[0011](2)复筛:分别挑取步骤(I)初筛中得到的芽孢杆菌并置于LB培养基中，于37°C、180rpm培养24h,之后1000rpm下离心6min,得发酵上清液备用；使用琼脂扩散法测定各发酵上清液的抑菌活性:以水产致病菌溶藻弧菌为指示菌制备抑菌板，用牛津杯大小的打孔器打孔后，每孔各加50uL发酵上清液，接着置于37°C生化培养箱培养8h，之后测量比较其抑菌圈直径，进而筛选出对该病原菌抑菌效果最好的菌株，将该菌株标记为菌株K2-1。
[0012]2.菌株的鉴定:
将筛选所得菌株K2-1接种至LB固体培养基，于37°C下培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下:菌落白色，表面粗糙，不透明，革兰氏阳性，产芽孢，葡萄糖发酵阳性，水解淀粉阳性。同时对该菌株进行16S rDNA测定，得其16s rDNA序列如SEQ IDNO:1所示。
[0013]将测得的16s rDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为蜡状芽孢杆菌QkiciIIus cereus);则结合生理生化测定结果及16s rDNA序列数据库比对结果，确定该菌株为腊状芽孢杆菌iBacillus cereus)?
[0014]3.一种防治水产养殖中病害的海洋源杀菌剂，其制备的具体步骤为:
(1)所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1的活化:取所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1并将其接种至斜面SLB培养基，且于30-40°C下培养12-48h ;用接种环将斜面培养后的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基上，并于30-40°C、150-200rpm条件下活化培养5_10h ；
(2)发酵液的制备:将步骤(I)活化好的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基中发酵培养接种量1_10%，搅拌速率150-200 rpm，温度设定为30_40°C ;发酵培养8_30h则获得所需的发酵液； (3)去菌体取步骤(2)所得的发酵液进行8000-1OOOOrpm离心5_10min，之后将离心所得的上清液进行水浴，水浴温度70-80°C、水浴时间10-20min，得到不含菌体的发酵上清液，备用；
(4)发酵液色谱分离:将步骤(3)所得的发酵上清液进行柱层析分离，使用层析柱填充为S印hadex G-50,洗脱液为H2O,收集时间为40_90min，上样量为柱体积1°/Γ5%，流速0.5?lmL/min ；
(5)杀菌剂成品:将步骤(4)收集到的收集液通过活性炭去色素，之后进行分装包装即可得所述海洋源杀菌剂的成品。
[0015]需要说明的是，本发明海洋源杀菌剂制备过程中进行发酵液色谱分离时，由开始加洗脱液洗脱起计时，0-40min的流出液为无效果的流出液，40_90min的流出液为有杀菌效果的产品液即本发明所需收集的收集液，90min后流出液亦是无效的流出液。
[0016]另外，本发明中所涉及到的:LB培养基的组分均为:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g, H2O 1000 mL ;固体LB培养基、SLB培养基的组分均为:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂 15g, H2O 1000 mL。
[0017]为了更好的对本发明中海洋源杀菌剂进行进一步阐述说明， 申请人:例举了如下实施例。
[0018]实施例一
菌株K2-1的活化:取所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1并将其接种至斜面SLB培养基，且于30°C下培养12h ;用接种环将斜面培养后的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基上，并于30°C、150rpm条件下活化培养5h ；
发酵液的制备:将活化好的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基中发酵培养接种量1%，搅拌速率150 rpm，温度设定为30°C ;发酵培养8h则获得所需的发酵液；
去菌体:取获得的发酵液进行SOOOrpm离心5min，之后将离心所得的上清液进行水浴，水浴温度70°C、水浴时间lOmin，得到不含菌体的的发酵上清液；
发酵液色谱分离:将所得的发酵上清液进行柱层析分离，使用层析柱填充为SephadexG-50，洗脱液为H2O,收集时间为40-90min，上样量为柱体积1%，流速0.5mL/min ；
杀菌剂成品:将步骤收集到的收集液通过活性炭去色素，之后进行分装包装即可得所述海洋源杀菌剂的成品。
[0019]实施例二
菌株K2-1的活化:取所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1并将其接种至斜面SLB培养基，且于35°C下培养15h ;用接种环将斜面培养后的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基上，并于35°C、170rpm条件下活化培养7h ；
发酵液的制备:将活化好的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基中发酵培养接种量5%，搅拌速率170 rpm，温度设定为35°C ;发酵培养18h则获得所需的发酵液；
去菌体:取获得的发酵液进行9000rpm离心8min，之后将离心所得的上清液进行水浴，水浴温度75°C、水浴时间15min，得到不含菌体的的发酵上清液；
发酵液色谱分离:将所得的发酵上清液进行柱层析分离，使用层析柱填充为SephadexG-50，洗脱液为H2O,收集时间为40-90min，上样量为柱体积3%，流速0.8mL/min ；
杀菌剂成品:将步骤收集到的收集液通过活性炭去色素，之后进行分装包装即可得所述海洋源杀菌剂的成品。
[0020]实施例三
菌株K2-1的活化:取所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1并将其接种至斜面SLB培养基，且于40°C下培养48h ;用接种环将斜面培养后的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基上，并于40°C、200rpm条件下活化培养1h ；
发酵液的制备:将活化好的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基中发酵培养接种量10%，搅拌速率200 rpm，温度设定为40°C ;发酵培养30h则获得所需的发酵液；
去菌体:取获得的发酵液进行1000rpm离心lOmin，之后将离心所得的上清液进行水浴，水浴温度80°C、水浴时间20min，得到不含菌体的的发酵上清液；
发酵液色谱分离:将所得的发酵上清液进行柱层析分离，使用层析柱填充为SephadexG-50，洗脱液为H2O,收集时间为40-90min，上样量为柱体积5%，流速lmL/min ；
杀菌剂成品:将步骤收集到的收集液通过活性炭去色素，之后进行分装包装即可得所述海洋源杀菌剂的成品。
[0021]4.对水产养殖中病害的防治试验
试验一:实施例一制备所得海洋源杀菌剂对受嗜水气单胞菌侵害的青石斑鱼的治疗试验
(I)试验方法:采用创伤方法，用嗜水气单胞菌对健康的青石斑鱼进行攻毒，使健康的青石斑鱼发病，然后选择12个实验桶，随机分成4组(D1、D2、D3和CKl )，每组三个平行，将已发病的鱼随机放入实验桶，每桶放养30尾。使用实施例一制备所得海洋源杀菌剂对发病青石斑鱼进行治疗:Dl组采用1ppm的浓度进行泼洒,每天一次,连续3天；D2组采用5ppm的浓度进行泼洒，每天一次，连续3天；D3组采用2.5ppm的浓度进行泼洒，每天一次，连续3天；CK组不做处理。
[0022](2)试验结果:使用1ppm实施例一制备所得海洋源杀菌剂的实验组即Dl组青斑鱼治愈率为46.6% ;使用5ppm实施例一制备所得海洋源杀菌剂的实验组即D2组青斑鱼治愈率为33.3% ;使用2.5ppm实施例一制备所得海洋源杀菌剂的实验组即D3组青斑鱼治愈率为23.3% ;未使用实施例一制备所得海洋源杀菌剂的的空白对照组即CKl组青斑鱼治愈率为0%。
[0023]试验二:实施例二制备所得海洋源杀菌剂对受嗜水气单胞菌侵害的青石斑鱼的治疗试验
(O试验方法:采用创伤方法，用嗜水气单胞菌对健康的青石斑鱼进行攻毒，使健康的青石斑鱼发病，然后选择12个实验桶，随机分成4组(A1、A2、A3和CK2)，每组三个平行，将已发病的鱼随机放入实验桶，每桶放养30尾。使用实施例二制备所得海洋源杀菌剂对发病青石斑鱼进行治疗:A1采用1ppm的浓度进行泼洒,每天一次,连续3天；A2组采用5ppm的浓度进行泼洒，每天一次，连续3天；A3组采用2.5ppm的浓度进行泼洒，每天一次，连续3天；CK2组不做处理。
[0024](2)试验结果:使用1ppm实施例二制备所得海洋源杀菌剂的实验组即Al组青斑鱼治愈率为66.6% ;使用5ppm实施例二制备所得海洋源杀菌剂的实验组即A2组青斑鱼治愈率为56.6% ;使用2.5ppm实施例二制备所得海洋源杀菌剂的实验组即A3组青斑鱼治愈率为43.3% ;未使用实施例二制备所得海洋源杀菌剂的空白对照组即CK2组青斑鱼治愈率为0%。
[0025]试验三:实施例三制备所得海洋源杀菌剂对受嗜水气单胞菌侵害的青石斑鱼的治疗试验
(O试验方法:采用创伤方法，用嗜水气单胞菌对健康的青石斑鱼进行攻毒，使健康的青石斑鱼发病，然后选择12个实验桶，随机分成4组(B1、B 2、B 3和CK3)，每组三个平行，将已发病的鱼随机放入实验桶，每桶放养30尾。使用实施例三制备所得海洋源杀菌剂对发病青石斑鱼进行治疗:B1组采用1ppm的浓度进行泼洒，每天一次，连续3天；B2组采用5ppm的浓度进行泼洒,每天一次,连续3天；B3组采用2.5ppm的浓度进行泼洒,每天一次，连续3天；CK3组不做处理。
[0026](2)试验结果:使用1ppm实施例三制备所得海洋源杀菌剂的实验组即BI组青斑鱼治愈率为60% ;使用5ppm实施例三制备所得海洋源杀菌剂的实验组即BI组青斑鱼治愈率为53.3% ;使用2.5ppm实施例三制备所得海洋源杀菌剂的实验组即BI组青斑鱼治愈率为36.6% ;未使用实施例三制备所得海洋源杀菌剂的空白对照组即CK3组青斑鱼治愈率为0%。
[0027]试验四:实施例二制备所得海洋源杀菌剂对受嗜水气单胞菌侵害的青石斑鱼的治疗试验
(I)试验方法:采用创伤方法，用溶藻弧菌对健康的青石斑鱼进行攻毒，使健康的青石斑鱼发病，然后选择12个实验桶，随机分成4组(C1、C2、C3和CK4)，每组三个平行，将已发病的鱼随机放入实验桶，每桶放养30尾。使用实施例二制备所得海洋源杀菌剂对发病青石斑鱼进行治疗:C1组采用1ppm的浓度进行泼洒,每天一次,连续3天；C2组采用5ppm的浓度进行泼洒，每天一次，连续3天；C3组采用2.5ppm的浓度进行泼洒，每天一次，连续3天；CK4组不做处理。
[0028](2)试验结果:使用1ppm实施例二制备所得海洋源杀菌剂的实验组即Cl组青斑鱼治愈率为56.6% ;使用5ppm实施例二制备所得海洋源杀菌剂的实验组即C2组青斑鱼治愈率为46.6% ;使用2.5ppm实施例二制备所得海洋源杀菌剂的实验组即C3组青斑鱼治愈率为33.3% ;未使用实施例二制备所得海洋源杀菌剂的空白对照组即CK4组青斑鱼治愈率为0%。
[0029]综上可知，本发明利用蜡状芽孢杆菌菌株K2-1 {Bacillus cereus K2_l)制备所得的海洋源杀菌剂，对于水产养殖中多种病原菌(如溶藻弧菌、嗜水气单胞、副溶血弧菌、爱德华氏菌，哈维氏弧菌等)均有较好的抑菌、防治效果；且使用过程对环境友好，无农药残留及污染问题，同时不存在对病原菌产生抗药性的特点，具有较好的生产应用前景。
【权利要求】
1.一种蜡状芽孢杆菌菌株，其特征在于:所述菌株为蜡状芽孢杆菌菌株K2-1{Bacillus cereus),于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCGMCC No: 9547。
2.一种防治水产养殖中病害的海洋源杀菌剂，其特征在于:其制备方法的具体步骤为: (1)权利要求1中所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1的活化:取权利要求1中所述的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1并将其接种至斜面SLB培养基，且于30-40°C下培养12_48h ;用接种环将斜面培养后的蜡状芽孢杆菌菌株K2-1接种至LB培养基上，并于30-40°C、150-200rpm条件下活化培养5-10h ; (2)发酵液的制备:将步骤(I)活化好的蜡状芽孢杆菌K2-1接种至LB培养基中发酵培养接种量1_10%，搅拌速率150-200 rpm，温度设定为30_40°C ;发酵培养8_30h则获得所需的发酵液； (3)去菌体:取步骤(2)所得的发酵液进行8000-1OOOOrpm离心5_10min，之后将离心所得的上清液进行水浴，水浴温度70-80°C、水浴时间10-20min，得到不含菌体的发酵上清液，备用； (4)发酵液色谱分离:将步骤(3)所得的发酵上清液进行柱层析分离，使用层析柱填充为S印hadex G-50,洗脱液为H2O,收集时间为40_90min，上样量为柱体积1%?5%，流速0.5?lmL/min ； (5)杀菌剂成品:将步骤(4)收集到的收集液通过活性炭去色素，之后进行分装包装即可得所述海洋源杀菌剂的成品。
3.如权利要求2所述一种防治水产养殖中病害的海洋源杀菌剂，其特征在于:所述LB培养基的组分均为:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g, H2O 1000 mL ;所述SLB培养基的组分为:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，H20 1000 mL。
【文档编号】A01N63/02GK104293707SQ201410500676
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】徐长安, 方卫东, 黄仕新, 唐旭, 刘源森, 林凌 申请人:国家海洋局第三海洋研究所