链霉菌菌株及其防治油菜菌核病联合应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了链霉菌菌株及其防治油菜菌核病联合应用，属于微生物【技术领域】，本发明所述的放线菌是从山东省泰安市郊区盐碱地采集的10~15cm深层土样中采用放线菌分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定，命名为龟裂链霉菌（Streptomycesrimosus）M527和金色链霉菌（Streptomycesaureofaciens）M930，S.rimosus2013已于2013年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2013270；S.aureofaciensM930已于2013年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2013711。两菌株均能发酵产生对油菜菌核病菌（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）具有较强拮抗作用的活性物质，可用于防治油菜菌核病害。两菌株的发酵产物按重量百分比为4:1混合制成混合制剂时，防治油菜菌核病的效果较两种代谢产物分别作为单一制剂使用时更为显著。
CCTCC NO: M 2013270
2013.06.19
CCTCC NO: M 2013711
2013.12.25
【专利说明】链霉菌菌株及其防治油菜菌核病联合应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，涉及两株生防放线菌一龟裂链霉菌M527和金色链 霉菌M930代谢产物在防治油菜菌核病中的应用。 技术背景
[0002] 油菜，原产我国，南北均有种植。油菜为低脂肪蔬菜，且含有膳食纤维，因此具有较 高的营养价值和药效功能。油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary) 引起的油菜菌核病是世界范围内的一种病害，在我国居油菜3大病害之首，菌核病主要危 害茎杆，引起植株早枯，角果减少，种子皱瘪，千粒重和出油率降低，产量下降，是影响油菜 产量和品质的主要因素之一。该病在我国长江中下游油菜主产区发生尤为严重，常年株发 病率高达10% - 30%。目前主要采用的防治措施以喷施化学农药苯丙咪唑类或二甲酰亚胺 等化学防治方式为主，这些化学药剂的长期使用导致了环境污染、人畜中毒等问题，引起了 人们的普遍关注。因此，生物防治引起人们的重视。在天然产物中，植物源农药的研究与 开发最为人们所关注目前有研究表明植物提取物中的活性成分对有一定的抑制作用，但植 物有效成分提取操作步骤多，效率低，但未见应用于实际生产；放线菌因其易产生抗病原菌 成分等活性物质，已成为生物防治植物病虫害的主要资源和生物农药开发的主要来源。国 内外在生物防治油菜菌核病方面已报道有抑制作用的大多为真菌和细菌，如木霉、荧光假 单胞菌和芽孢杆菌，从土壤中筛选拮抗放线菌对油菜菌核病原菌的生物防治报道还并不多 见。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于通过筛选提供对油菜菌核病 原菌具有较强拮抗作用的两株生防菌一菌龟裂链霉菌M527和金色链霉菌M930。
[0004] 本发明的第二个目的是通过不同的比例混合两株生防链霉菌的发酵产物，提供上 述菌龟裂链霉菌和金色链霉菌在油菜菌核病防治中的联合应用。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术手段得以实现： 本发明首先以在山东省泰安市郊区盐碱地采集的土样为研究对象，经分离、发酵培养、 发酵液提取以及对植物病原真菌抑制活性检测等步骤获得两株对油菜菌核病原菌具有较 强抑菌活性的链霉菌；其中一株经微生物分类学鉴定并命名为龟裂链霉菌 τΥ?〇·?Λ5)Μ527。该菌已于2013年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为： CCTCC NO: M 2013270;另一株经微生物分类学鉴定并命名为金色链霉菌(泣 atfreo/acieas)M930,该菌已于2013年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为CCTCC NO: M 2013711。中国典型培养物保藏中心地址：武汉市武昌珞珈山，邮编： 430072。
[0006] 本发明所述的龟裂链霉菌M527在PDA固体培养基上培 养时气丝白色至灰色，基丝乳脂色。显微观察发现M527孢子丝初 旋至螺旋形。孢子长圆形至柱形，表面光滑。本发明所述的5^-6?^0?_7<^?>5/^?05^5]/[527， 发酵液经提取浓缩后可对油菜菌核病病原真菌具有较强的抑制作用。
[0007] 本发明所述的金色链霉菌(SirepioffiiFce1S 在PDA固体培养基 上培养时气丝白色，基丝褐色。显微观察发现5?/·--/7?〇?_7----5· <3?Γ--〇/<3--Υ--/75·Μ930孢子丝紧 密螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑。本发明所述的5?/·--/7?ο?_7----5· atfreo/acie/75· Μ930,发酵 液经提取浓缩后可对油菜菌核病病原真菌具有较强的抑制作用。
[0008] 所述的油菜菌核病原菌拮抗放线菌的筛选和抑菌活性检测过程如下所述： (1) 从野外（山东省泰安市郊区盐碱地）采集土样，并进行晾干处理； (2) 从土样中分离放线菌，并利用油菜菌核病原菌作为指示菌筛选具有拮抗作用的放 线菌； (3) 将长出的放线菌分别点种于混有油菜菌核病原菌孢子悬液（IXlO6 cfu·!!^1)的 PDA平板上，通过观察抑菌圈大小，挑选抑菌圈较明显的菌株进入复筛； (4) 将选取的菌株进行发酵培养，发酵结束后离心收集发酵液，用乙酸乙酯萃取，真空 减压浓缩后制备浸膏，用于油菜菌核病的防效检测，由此筛选出防治效果较好的两株拮抗 微生物一龟裂链霉菌M527和金色链霉菌M930。
[0009] 本发明的有益效果： 本发明从土壤中分离筛选出对油菜菌核病原菌具有较强抑制作用的两株拮抗链霉菌 5?/·<9/7?ο?_7--(95· ri避λ5?5· M527 和 5?/·<9/7?ο?_7--(95· atfreo/aciefls M930,两株菌株的发酵产物 按重量百分比为4:1制成的混合制剂可用于油菜菌核病病害的防治，为生物农药的开发提 供了新的途径。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1:(5^/'(9/^〇?/^(9>5/'/?〇5^5]\1527和5^/'(9/^〇?/^(9 >5<3?/'(9〇/'<3<^(9/7>5]\1930的 分离与筛选） 按以下步骤进行： (1) 材料及培养基：用于分离龟裂链霉菌M527和金色链霉菌M930的材料为采自山东 省泰安市郊区盐碱地的土样，用于放线菌分离所用的培养基为含重铬酸钾的PDA培养基 (配方为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加蒸馏水IL煮沸半小时，纱布过滤，再加20g葡 糖糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121°C，高压灭菌 20min;使用时添加重铬酸钾20yg · ml/1 ;以下试验中放线菌常规培养所用培养基均以蒸 馏水配置）； (2) 分离纯化：将上述新鲜采集的土样装于采样袋中，带回实验室后分装晾干一周左 右；瞭干后的土样每份称取5g，分别加入含有45ml无菌水的锥形瓶中，锥形瓶中加入3-5 粒无菌的玻璃珠，28°C摇床培养2h，使土样中的微生物充分进入水中；吸取培养后的样品 以10倍梯度稀释，分别取10' 10' KT4浓度稀释液200 μ L，涂布于含20 μ g · ml/1重铬酸 钾的PDA固体平板上，28°C培养72h ;将平板上长出的放线菌分别挑取单菌落，接种于含重 铬酸钾的新鲜PDA平板上，28°C ± 1°C条件下纯化培养72h，获得纯化后的放线菌； (3) 初筛和复筛：将分离得到的放线菌分别点种于混有油菜菌核病原菌孢子悬液 (I X IO6Cfu ^171)的PDA固体平板上，通过观察抑菌圈大小，挑选抑菌圈较明显的菌株进行 复筛； 复筛采用平板对峙法对初筛的放线菌进行抑菌活性测定，具体方法为：在PDA固体平 板上分别对称放置一个直径4mm的放线菌菌饼和一个油菜菌核病原菌菌饼，置培养箱中 28°C ±1°C条件下培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直 径。抑菌率通过以下公式计算： 抑菌率（%) = (1-处理菌落生长半径/对照菌落生长半径）X 100 根据结果获得抑菌活性较好的两株放线菌，对油菜菌核病原菌的抑菌率均在70%以 上。综合16SrDNA序列的比对结果、形态特征、培养特征和生理生化特性，其中一株菌株鉴 定为龟裂链霉菌，命名为龟裂链霉菌M527 另一株菌株鉴定 为金色链霉菌，命名为金色链霉菌Μ930 atfreo/aciefls M930);保存。
[0011] (4) ri避M527 和 atfreo/aciefls M930 抑菌 活性测定：将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的M5 2 7和 5?/·<9/7?ο?_7--(95· M930 按 5% (v/v)分别接入发酵培养基中，28°C ±1°C条件 下，180 r/min，摇床培养120h后，7800 r/min离心7 min,用滤纸过滤得发酵滤液。取经 0. 22 μ m膜过滤的发酵上清液ImL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速 混勻，冷却后在每个培养基平面中央分别放1个直径为4mm的油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum (Lib. )de Bary)菌饼，置培养箱中28°C培养72h，以无菌水处理作为对照， 重复3次；待对照菌落直径长至平板直径的2/3左右时统计结果，采用十字交叉法测定菌落 直径，以下列公式计算抑制率： 菌丝生长抑制率（％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径）/(对照菌落直径-4)] X100 测定结果表明：5?-印ri避M527 和 M930 代 谢产物对油菜菌核病菌菌丝生长抑制率分别为76. 2%和72.8%。
[0012] 实 -.iStreptomyces rimosus --? 私 Streptomyces aureofaciens 船？ 酵代谢产物的制备方法） 按以下步骤进行： (1) 菌种的活化培养：将保存的 SirepioffiiFce1S riffiosiAs M527 和 SirepioffiiFce1S atfreo/acie/75· M930孢子悬液（I X IO8 cfu · ml/1)接入马铃薯葡萄糖液体培养基，在 28°C ±1°C条件下培养48h供发酵使用； (2) 发酵培养：发酵培养基每I L中含有黄豆饼粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g， 葡萄糖5g，蛋白胨5g，CoCl2 0. 02g，牛肉膏5g，CaCO3 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶装 发酵培养液50mL ;配制后121°C灭菌20min，将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的 Streptomyces rimosus WiTJ 热 Streptomyces aureofaciens 船说 傲牙h {? h、後\ 发酵培养基中，在28°C ±1°C条件下，摇床转速180 r/min，发酵培养84 h; (3) 发酵物提取：发酵完毕，离心，弃菌体，收集发酵液于分液漏斗中，将加入等体积的 乙酸乙酯萃取，充分混匀，待分层后，取上层液相至圆底烧瓶，利用旋转蒸发仪浓缩后获得 萃取物浸膏，用于测定抑菌活性。
[0013] 以下实施例 3 和试验例中所述的 5?/·<9/7?ο?_7--(95· ri避λ5?5· M527 和 5?/·<9/7?ο?_7--(95· Μ930代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量/体 积百分比。
[0014] 实施例 3 : (5?/·<9/7?ο?_7--(95· ri避λ5?5· M527和5Yr<9/7io?_7c<95· atfreo/aciefls M930代 谢产物对油菜菌核病菌的抑制作用） (1) 分别准确称取 Str印i〇?_Fc<95· ri避λ5?5· M527 和 SirepioffiiFce1S atfreo/aciefls M930 代谢产物〇. lg，并加入IOmL体积的无菌水，超声波震荡充分溶解，分别配置终浓度为10 g/ L的母液； (2) 抑菌活性测定：取上述母液分别稀释成浓度为lg/L和0. 5g/L的溶液，取各浓度溶 液ImL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50 °C的PDA培养基迅速混勻（SirepioffiiFce1S M527 和 5?/·<9/7?ο?_7--(95· M930 代谢产物终浓度分别均为 0. lg/L 和 0. 05g/L), 冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的油菜菌核病菌菌饼，菌饼接于培养皿中 央（培养皿直径为9cm)，置培养箱中28°C培养36h，以常规化学药剂和无菌水处理作为对 照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率： 菌丝生长抑制率（％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径）/(对照菌落直径-4)] XlOO 试验例：(本发明产品与常规农药防治效果对比试验） 试验结果见表 1。从表 1 看出，ri避λ5?5· M527 和 5?/·(9/7?〇?_7--(95· Μ930代谢产物抑制油菜菌核病菌效果较常规化学药剂略优，当两者代谢产 物按照4:1质量百分比混合制成混合制剂时，防治油菜菌核病的效果较两种代谢产物分别 作为单一制剂使用时更为显著。
[0015] 表 I SirepioffiiFce1S ri避λ5?5· M527 和 SirepioffiiFce1S atfreo/aciefls M930 代谢产 物对供试的油菜菌核病原菌的抑制效果及比较
【权利要求】
1. 一种链霉菌菌株，其特征在于：菌株M527分类命名为龟裂链霉菌(泣 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日：2013年6月19日，保藏登 记号为CCTCC NO: M 2013270;另一种链霉菌菌株M930,菌株M930分类命名为金色链霉菌 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日：2013 年12月25日，保藏登记号为CCTCC NO: M 2013711。
2. -种如权利要求1所述的链霉菌菌株的应用，其特征在于：所述的龟裂链霉菌M527 和金色链霉菌M930均能发酵产生对油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum (Lib. )de Bary)具有较强拮抗作用的活性物质，可防治油菜菌核病病害，M527和M930两者的代谢产 物重量百分比为4:1时，效果尤为显著。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的M527和M930两者的代谢产物的制备 方法如下： (1) 将分离得到的龟裂链霉菌M527和金色链霉菌M930涂布于甘露醇黄豆饼粉制成的 MS平板上，收集孢子接种于发酵培养基； (2) 发酵培养基为每I L中含有黄豆饼粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g，葡萄糖5g， 蛋白胨5g，CoCl2 0.02g，牛肉膏5g，CaCO35g，酵母膏5g，每300mL三角瓶装发酵培养液 50mL ;配制后121°C灭菌20min，将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的 M527和Stre/?(offices M930分别按5% (v/v)接入发酵培养基中， 在28°C ±1°C条件下，摇床转速180 r/min，发酵培养84 h; (3)发酵结束后离心收集发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，充分震荡混匀，取上层，在真 空条件下浓缩至浸膏； (4)混合制剂配制：将 M527 和 aureo/aciefls M930代谢产物用水溶解，混合，配成终浓度为0. 08g/L泣M527代谢产 物和 0. 02g/L M930 代谢产物混合配方制剂。
【文档编号】A01N63/00GK104312948SQ201410509418
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】马正, 俞晓平, 路丹丹, 罗帅, 边亚琳, 王正亮, 申屠旭萍 申请人:中国计量学院