一种海红豆悬浮细胞和再生植株的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种海红豆悬浮细胞和再生植株的快速繁殖方法，包括外植体的消毒、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养、胚性悬浮细胞的诱导、生根诱导等步骤，本发明方法建立了海红豆胚性细胞悬浮体系并获得了海红豆再生植株，不仅为其药用成分的开发和利用提供原料，亦可获得大量的海红豆再生植株，为其大规模栽培奠定基础。
【专利说明】—种海红豆悬浮细胞和再生植株的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及海红豆悬浮细胞和再生植株培养的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]海红豆，Adenantherapavonlna,豆热，落叶小乔木，高5_10m, 二回羽状复叶,具短柄，叶柄和叶轴被微柔毛，无腺体，互生，两面均被微柔毛；总状花序单生于叶腋或在枝顶排成圆锥花序，被短柔毛，花小，白色或淡黄色，有香味，具短梗，花萼长不足1mm，与花梗同被金黄色柔毛，花瓣5，披针形，长2.5-3mm,无毛，基部稍合生；荚果狭长圆形，盘旋，开裂后果瓣旋卷；种子近圆形至椭圆形，长5-8mm，宽4.5_7mm，鲜红色，有光泽，花期4-7月，果期7-10月。海红豆喜温暖湿润气候、喜光，稍耐荫，对土壤条件要求较严格，喜土层深厚、肥沃、排水良好的沙壤土，原产于热带地区，緬甸、柬埔寨、老挝、越南、马来西亚、印度尼西亚、中国，在中国分布于福建、台湾、广东、海南、广西、贵州、云南等地。海红豆种子含豆留醇，豆甾醇葡萄糖甙，卫矛醇，多糖及蛋白酶抑制剂和8种胰蛋白酶同效抑制剂DE1-DE8等，根有催吐、泻下作用；叶则有收敛作用，可用于止泻，疏风清热，燥湿止痒，润肤养颜，目前主要采用种子和扦插繁殖，成本高，且成活率偏低，尚不能满足市场需求。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是海红豆悬浮细胞培养的繁殖方法，建立了海红豆胚性细胞悬浮体系并获得勒海红豆再生植株，不仅为其药用成分的开发和利用提供原料，亦可获得大量的海红豆再生植株，为其大规模栽培奠定基础。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取海红豆叶片，在洗衣粉中浸泡3min,流水冲洗15min,超净工作台上1%溴水处理8min，流水冲洗5次，消毒处理过的叶片接入MS+3-4 μ mo I/L生物素+0.3mg/L ΝΑΑ+0.5-1mg/L油菜素内酯培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，诱导出来的愈伤组织接入培养基MS+500-600 μ mo I/L谷氨酰胺+3-4 μ mo I/L生物素+2，4-D 0.2mg/L中进行悬浮细胞培养，附加30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，旋转摇床振荡，110r/min,悬浮细胞在培养的第一个月中，每周更换一次新鲜培养基，用800 μ m孔径筛网滤除不易分散的大颗粒培养物，其中包括愈伤组织团、褐化死亡组织、一些原胚等，其后每2周更换一次培养液，待培养物较为分散后，用150 μ m孔径筛网过滤去除较大的细胞团，培养的悬浮细胞接入培养基MS+CPPU 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+ZT 0.5mg/L中进行胚性悬浮细胞诱导，诱导出来的胚性细胞接入不含任何激素的MD培养基中进行生根诱导，植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28°C、30ymol.m_2.s—1光强(白色荧光灯)，16h/8h光周期条件下生根，获得再生植株。
[0005]采用本发明制备的海红豆细胞和再生植株增殖成活率高，生长周期短，生产过程简单易控，利于规模化生产和栽培。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取海红豆叶片，在洗衣粉中浸泡3min,流水冲洗15min,超净工作台上1%溴水处理8min，流水冲洗5次，消毒处理过的叶片接入MS+3 μ mo I/L生物素+0.3mg/LNAA+0.5mg/L油菜素内酯培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，诱导出来的愈伤组织接入培养基MS+500 μ mo I/L谷氨酰胺+3 μ mo I/L生物素+2，4-D0.2mg/L中进行悬浮细胞培养，附加30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，旋转摇床振荡，110r/min,悬浮细胞在培养的第一个月中，每周更换一次新鲜培养基，用800 μ m孔径筛网滤除不易分散的大颗粒培养物，其中包括愈伤组织团、褐化死亡组织、一些原胚等，其后每2周更换一次培养液，待培养物较为分散后，用150 μ m孔径筛网过滤去除较大的细胞团，培养的悬浮细胞接入培养基MS+CPPU0.3mg/L +NAA0.2mg/L+ZT0.5mg/L中进行胚性悬浮细胞诱导，诱导出来的胚性细胞接入不含任何激素的MD培养基中进行生根诱导，植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28°C、30ymol.πΓ2.s—1光强(白色荧光灯)，16h/8h光周期条件下生根，获得再生植株，悬浮细胞增殖率78%，再生成活率89%。
[0008]实施例2
取海红豆叶片，在洗衣粉中浸泡3min,流水冲洗15min,超净工作台上1%溴水处理8min,流水冲洗5次,消毒处理过的叶片接入MS+4 μ mol/L生物素+0.3mg/LNAA+lmg/L油菜素内酯培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，诱导出来的愈伤组织接入培养基MS+600 μ mol/L谷氨酰胺+4 μ mol/L生物素+2，4-D0.2mg/L中进行悬浮细胞培养，附加30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，旋转摇床振荡，110r/min,悬浮细胞在培养的第一个月中，每周更换一次新鲜培养基，用800 μ m孔径筛网滤除不易分散的大颗粒培养物，其中包括愈伤组织团、褐化死亡组织、一些原胚等，其后每2周更换一次培养液，待培养物较为分散后，用150 μ m孔径筛网过滤去除较大的细胞团，培养的悬浮细胞接入培养基MS+CPPU 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+ZT 0.5mg/L中进行胚性悬浮细胞诱导，诱导出来的胚性细胞接入不含任何激素的MD培养基中进行生根诱导，植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28°C、30ymol.πΓ2.s—1光强(白色荧光灯)，16h/8h光周期条件下生根，获得再生植株，悬浮细胞增殖率80%，再生成活率91%。。
[0009]实施例3
取海红豆叶片，在洗衣粉中浸泡3min,流水冲洗15min,超净工作台上1%溴水处理8min,流水冲洗5次,消毒处理过的叶片接入MS+4 μ mol/L生物素+0.3mg/LNAA+lmg/L油菜素内酯培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，诱导出来的愈伤组织接入培养基MS+500 μ mol/L谷氨酰胺+4 μ mol/L生物素+2，4-D0.2mg/L中进行悬浮细胞培养，附加30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，旋转摇床振荡，110r/min,悬浮细胞在培养的第一个月中，每周更换一次新鲜培养基，用800 μ m孔径筛网滤除不易分散的大颗粒培养物，其中包括愈伤组织团、褐化死亡组织、一些原胚等，其后每2周更换一次培养液，待培养物较为分散后，用150 μ m孔径筛网过滤去除较大的细胞团，培养的悬浮细胞接入培养基MS+CPPU0.3mg/L +NAA0.2mg/L+ZT0.5mg/L中进行胚性悬浮细胞诱导，诱导出来的胚性细胞接入不含任何激素的MD培养基中进行生根诱导，植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28°C、30ymol.πΓ2.s—1光强(白色荧光灯)，16h/8h光周期条件下生根，获得再生植株，悬浮细胞增殖率80%，再生成活率94%。。
【权利要求】
1.一种海红豆悬浮细胞和再生植株的快速繁殖方法，包括外植体的消毒、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养、胚性悬浮细胞的诱导、生根诱导，其主要步骤如下: (1)取海红豆的幼嫩叶片，进行消毒处理； (2)取步骤(1)消毒处理过的叶片接入MS+3-4μ mol/L生物素+0.3mg/LNAA+0.5-lmg/L油菜素内酯培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L乳糖，温度25°C，暗培养； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织接入培养基MS+500-600ymol/L谷氨酰胺+3-4 μ mol/L生物素+2，4-D 0.2mg/L中进行悬浮细胞培养，附加30g/L乳糖，温度25°C，暗培养，旋转摇床振荡，110r/min ； (4)取步骤(3)培养的悬浮细胞接入培养基MS+CPPU0.3mg/L+NAA0.2mg/L+ZT0.5mg/L中进行胚性悬浮细胞诱导； (5)取步骤(4)诱导出来的胚性细胞接入不含任何激素的MD培养基中进行生根诱导，获得再生植株。
2.按照权利要求1所述的一种海红豆悬浮细胞和再生植株的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(1)中所述海红豆无菌叶片的获得为，取海红豆叶片，在洗衣粉中浸泡3min，流水冲洗15min，超净工作台上1%溴水处理8min，流水冲洗5次。
3.按照权利要求1所述的一种海红豆悬浮细胞和再生植株的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(3)悬浮细胞在培养的第一个月中，每周更换一次新鲜培养基，用800μπι孔径筛网滤除不易分散的大颗粒培养物，其中包括愈伤组织团、褐化死亡组织、一些原胚等，其后每2周更换一次培养液，待培养物较为分散后，用150 μ m孔径筛网过滤去除较大的细胞团。
4.按照权利要求1所述的一种海红豆悬浮细胞和再生植株的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)植株再生初期的体细胞胚萌发在黑暗条件下进行，待浅绿色叶鞘抽出后转移到28°C、30 μ mol.πΓ2.s_1光强(白色突光灯)，16h/8h光周期条件下生根。
【文档编号】A01H4/00GK104255531SQ201410550655
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】刘东锋, 杨成东 申请人:南京帝道农业科技有限公司