稻瘟病菌无毒基因AvrPib及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】，具体公开了一种稻瘟病菌无毒基因 AvrPib 及其应用。所述无毒基因具有SEQIDNO：1所示的带有启动子的DNA序列或SEQIDNO：2所示的cDNA序列。基于所述基因的结构及其应用试验结果，可以设计新型农药的分子靶点；将该基因和相应的抗病基因共价导入水稻等寄主植物可以培育抗病新品种；根据该基因序列产生的特异性分子标记可应用于田间稻瘟病菌群体监测；所得到的监测结果也可用于指导抗病品种合理布局；所述基因具有广泛的应用价值，对于水稻生产和育种等研究具有重大意义。
【专利说明】稻瘟病菌无毒基因^!^/7/'/?及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种稻瘟病菌无毒基因JKTftl及其应 用。
【背景技术】
[0002] 水稻Z.)是全世界数十亿人口赖以生存的重要粮食作物和重要的 工业原料，同时也是多种病虫害的宿主。由病原真菌#^§?<3/70从e 引起的稻癌病是 世界水稻生产上最具毁灭性的病害之一，每年都造成10?30%的水稻产量损失。而且该菌 还能够侵染麦类、谷类等50多种禾本科植物。
[0003] 从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病 最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，使得抗病品种的抗性不稳 定，以致抗病品种的感病化问题一直没有得到解决。稻瘟病菌菌株能否在特定品种上侵染、 致病是由该病原菌菌株的无毒基因的产物与寄主植物的抗病基因产物之间的互作决定的。 因此，对无毒基因产物结构的分析与研究，是了解病原菌小种和寄主品种专化性互作的生 化基础。从病原菌无毒基因着手，可望阐释稻瘟病菌与水稻的互作关系，以及病原菌的致 病机理，从而为稻瘟病抗病育种打下坚实的基础，对于植物病害的预防和控制具有重要的 指导意义。
[0004] 迄今，已克隆的9个稻瘟病菌无毒基因根据其功能可以分为两类。第一类无毒基 因编码种间特异性的激发子。这一类包括了对弯叶画眉草carra/a)表现非 致病特异性的(pathogenicity on weeping Iovegrass)基因家族。在这个基因家族 中，首先通过图位克隆的方法被分离、克隆，该基因起着阻止稻瘟病菌株侵染弯叶画眉 草的作用（Sweigard et al. 1995，Plant Cell 7: 1221-1233)。用/转化对弯叶画眉 草有致病性的野生型菌株，转化子失去了弯叶画眉草的致病性，却完全保留了对其它寄主 的致病性。这说明尽管是一个决定寄主范围的基因，但其功能与经典定义的无毒基因 是一样的。/ 7/?之编码富含甘氨酸的亲水性蛋白，内含一个信号肽。
[0005] 第二类无毒基因为通常意义上的无毒基因，即编码品种特异性(专化性）的激发 子。这一类基因包括(以前称 及但这3个基因在稻癌病菌生长发育方面具有什么样的功能还有 待于进一步的研究。
[0006] 尽管到目前为止，随着分子生物学的快速发展，大约已经有40个稻瘟病菌无毒 基因完成了染色体的初步定位，但已被克隆的无毒基因却只有9个。在这9个稻瘟病菌 无毒基因中，/覺7 (Kang et al. 1995，Molecular Plant-Microbe Interactions 8: 939-948)和(前出，Sweigard et al. 1995)都是控制稻瘟病菌对弯叶画眉草的致病 性，具有强烈的寄主特异性；而另外7个无毒基因(Orbachet al. 2000，Plant Cell 18: m-m),AVRl-C039 (Farman and Leong 1998, Genetics 150: 1049-1058), ACEl (B5hnert et al. 2004, Plant Cell 16: 2\m~2^\?>),AvrPiz-t (Li et al. 2009, Molecular Plant-Microbe Interactions 22: 和 如（Yoshida et al. 2009，Plant Cell 21: 1573-1591)均来源于水稻，控制稻瘟病菌对 水稻的致病性。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中对稻瘟病无毒基因研究的缺陷，提 供一种新的稻瘟病菌无毒基因
[0008] 本发明的第二个目的是提供上述稻瘟病菌无毒基因所编码的蛋白质。
[0009] 本发明的第三个目的是提供含有上述无毒基因的载体。
[0010] 本发明的第四个目的是提供含有上述载体的重组体。
[0011] 本发明的第五个目的是提供上述基因在培育植物新品种中的应用。
[0012] 本发明的第六个目的是提供上述基因在制备植物分子农药中的应用。
[0013] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 一种稻瘟病菌无毒基因其具有SEQ ID NO :1所示的带有启动子的DNA序列或 SEQ ID NO :2所示的cDNA序列。
[0014] 上述稻瘟病菌无毒基因编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO :3所示序列。
[0015] 本发明从稻瘟病菌菌株CHL42中分离得到基因，该基因赋予稻瘟病菌对含 有抗病基因的水稻品种产生特异性(专化性）的非致病性反应。其中，所述SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO :2分别是的基因组DNA和cDNA序列。基因组DNA长度为 2618 bp，其全长cDNA为637 bp，含有一个225 bp的开放阅读框，5'和3'非翻译区分别为 322 bp和90 bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放阅读框只有1个外显子 而没有内含子（图3a)。该基因编码SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，结构如图3a所示；该 基因编码的蛋白的N末端含有22个氨基酸组成的信号肽。
[0016] 所分离、克隆的无毒基因加在自然界中存在若干个SNP单元型，且这些单元 型编码的蛋白之间存在非同义替换关系。因此，应当理解，在不影响蛋白活性的前提下(不 在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列进行各种替换、 添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列、功能片段和/或突变 体。
[0017] 含有上述稻瘟病菌无毒基因的载体。
[0018] 含有上述基因或载体的重组体。该重组体可以是将无毒基因以任一种方 法与任一种载体相结合形成的重组体。
[0019] 根据本发明提供的基因序列信息（SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2)，本领域 技术人员可以通过以下方法容易地获得与等同的基因：（1)通过数据库检索获得； (2) 以基因片段为探针筛选稻瘟病菌或其它病原菌的基因组文库或CDNA文库获得； (3) 根据基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从稻瘟病菌或其它病 原菌的基因组、HiRNA和CDNA中获取；（4)在基因序列的基础上用基因工程方法改 造获得；（5)用化学合成的方法获得该基因。
[0020] 本发明能够进一步提供或应用利用上述稻瘟病菌无毒基因的DNA片段获 得的无毒性的转基因菌株，以及利用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的菌株。也 可以利用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的菌株中。
[0021] 本发明提供的稻瘟病菌无毒基因具有重要的应用价值： 应用之一是根据该基因的结构及其功能来设计新型农药的分子靶点，可用于制备植物 分子农药。
[0022] 应用之二是培育植物抗病新品种，具体地，将所述的基因序列连接到任 何一种转化载体，用任何一种转化方法将无毒基因和相应的抗病基因共价导入 水稻或其他植物细胞。也就是说，将无毒基因置于病原菌侵入诱导表达的启动子下，而将相 应的抗病基因置于组成型表达的启动子下，一起导入寄主植物中，当寄主受到病原菌侵染 时，无毒基因便被诱导表达无毒蛋白，然后无毒蛋白作为激发子，激发其特异的抗病基因表 达，产生对应的受体蛋白，它们之间相互识别，导致寄主产生过敏性反应，以阻止入侵病原 菌的定殖和扩展。由于这种工程植物是基于寄主抗病反应后各种防卫反应的综合表达和作 用，因此，这种新型的抗性是稳定而持久的。
[0023] 对基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。对该基因的编 码区的单个核苷酸位点进行定点突变，可能会导致基因无毒性功能的丧失或改变。本发 明同样包括将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条 件下侵入植株的不同时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启 动子、构巢曲霉trpC启动子等（冯淑杰2005,华南农业大学博士论文；Li et al.，2010， Molecular Plant-Microbe Interactions 23: 317-331)。另一方面，也可以将该基因和一 个组织特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动 子。这样，环境的改变，侵入植株的不同时期都可以改变该基因的表达。其中环境条件包含 植株的生长状况，温度，湿度等，侵入植株的不同时期包括孢子萌发、附着胞形成、侵染钉分 化和侵染菌丝扩展等。
[0024] 优选地，上述植物可以是禾本科植物，如水稻。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种新的稻瘟病菌无毒基因所述基因由菌株CHL42通过图位克 隆的方法获得，所述无毒基因具有广泛的应用价值：基于所述基因的结构及其应用试验结 果，可以设计新型农药的分子靶点；通过转基因技术，将本发明所述基因遗传转化到毒性菌 株中，以生产所述基因的等基因（或近等基因）菌株，这些菌株可广泛应用于农药开发、稻瘟 病菌小种监测，以及理论研究等方面；利用所述基因的序列及其编码的产物，通过生物化学 等手段，找到与之特异性互作的寄主植物(如水稻等）的蛋白质，由此了解和揭示稻瘟病菌 小种与水稻等品种间特异性互作的分子机理，以此来设计稻瘟病综合防治的新策略。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明采用的稻瘟病菌无毒基因的克隆及其功能研究的技术路线 图； 图2为稻瘟病菌无毒基因的图位克隆图；其中图a为位点的遗传图 谱；连锁标记下数值为重组体/配子体；水平线下数值为标记之间的相对遗传距离（CM); 图b为位点的电子物理图谱；水平线下数值为根据参考菌株70-15的基因组序列 (http://www. broad, mit. edu)推测的物理距离（kb);图c为位点的重叠群图；图d 为的候选基因及精细电子物理图谱；图e为候选基因的克隆及其遗传转化； 图3为的基因结构、蛋白质序列以及突变体；其中图a为的基因结构图； 图b为jKrftT?的蛋白序列图，下划线部分为信号肽；图c为jKrftT?的基于PCR技术的定点 突变(左）及缺失突变(右）示意图；F1/R1，F2/R2分别为PCR引物；图d为突变体的 结构示意图及其致病性鉴定结果;为的对应抗病基因，/--及为的 非对应抗病基因，以检测二者的特异性互作关系；供体菌株（CHL42)及受体菌株（CHL724) 作为对照也用于致病性鉴定；R :抗病性(无毒性);S :感病性(有毒性）;MS :中度感病性（中度 有毒性）； 图4为作图群体的亲本菌株（CHL42, CHL357)、遗传转化受体菌株（CHL724)以 及突变体菌株(Mab系列)在水稻品种IRBLb-B (含基因)上的表型鉴定图；无菌水作为 接种物对照也用于致病性鉴定； 图5为的特异性分子标记及其检测图；其中图a为特异性分子标记PCR 引物的设计示意图;的编码区用黑框表示，各个引物的相对位置标示于水平线下； 图b为基于标记Jkt/^FI/RI的基因型(左)、基于标记Jkt/^F2/R2的基因型（中），以及基 于2个标记的整合基因型(右）;M1 :DNA分子量标记，DL2000 ;M2 :DNA分子量标记，DL15000 ; 8个菌株（a-h)有关JKr/^的"表型/基因型"最终由各个菌株对水稻品种IRBLb-BGp^)的 致病型及整合基因型决定，a :V/1 (CHL26OO) ;b:V/l (CHL2626);c:V/2 (EHL〇348);d:A/3 (CHL2345) ；e ：V/4 (EHL0342) ；f ：V/1 (CHL2549) ；g ：V/3 (EHL0964) ； h: V/0 (EHL0370)〇
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或 替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。在本发明的实施例部分，阐述了 基因的分离克隆、功能特征、分子 鉴定以及应用，分离的基因能够与适当的载体连接，转入菌株中，使该菌株对含有 特异性互作的抗病基因产从的植物产生无毒性。
[0028] 本发明采用的技术路线如图1所示。
[0029] 实施例1稻瘟病菌无毒基因的图位克隆 (I ) J 位点遗传图谱的构建 为了发掘和鉴定稻瘟病菌无毒基因利用由稻瘟病菌株CHL357 (交配型 拗/7-7;对含有/--的水稻品种IRBLb-B表现有毒性；Hua et al. 2012，Theor Appl Genet 125: 1047-1055)和 CHL42 (交配型姻77-J;对 IRBLb-B表现无 2014，Plos One 9: e98067)杂交得到的83个后代子囊孢子菌株接种水稻品种IRBLb-B (Kobayashi et al. 2007，JARQ 41: 31-37)，结果表明，这个作图群体中无毒性(非致病 性）菌株与有毒性(致病性）菌株分别为41和42株，其分离比符合1:1。由此推断，CHL42 所表现的对水稻品种IRBLb-B的无毒性是由一对显性基因控制的。
[0030] 为了快速地确定无毒基因的染色体位置，利用参考菌株75-10的参考序列 (reference sequence)，开发并构建了由 121 个微卫星标记（SSR, simple rsequence repeat)组成的遗传图谱（Feng et al. 2007, Chinese Science Bulletin 52: 3346-3354)。然后，通过混合群体分离分析法（bulked-segregant analysis, BSA)，筛选 了全部121个SSR标记，得到了 7个与无毒基因连锁的SSR标记（MS6-24, MS6-3, MS6-7， MS6-10, MS6-17, MS3-5, MS3-26)。SSR 标记序列如下： MS6-24F ：GCGAGTTTACAGGTTTAGCA MS6-24R ：TTTGGGGCTAATAACAGACC Ms6-3F ：CCACATCGCAGCCTCACTTG Ms6-3R ：CCAGTCGGTTCCAGGTCTTG Ms6-7F ：CCAAGGCACCAGCACAGACC Ms6-7R ：CAGAAGATGCCTCGGAGATC Ms6-10F ：CAGAAGATGCCTCGGAGATC Ms6-10R ：GCAGGGCCCACTACACATGT Ms6-17F ：CAAGAATGCAGAGAACCACAG Ms6-17R ：GTTTTCCGCTGTGTAAATAGA Ms3_5F :gagtttgagaccttgcgatt Ms3_5R :ggcggcaagtcgctgaagg Ms3-26F ：GAAGGCGACAAGTGGCAGT Ms3-26R ：CTCGTCTGGTATCAGTTGCC 结果表明，该无毒基因位点被定位在第6染色体上。为了进一步确认该无毒基因的位 置，分别在SSR标记MS6-17-MS3-5,以及MS3-26右侧开发了 1个和3个新标记进行连锁 分析。结果表明，该无毒基因位点被确定于SSR标记MS3-5-MS3-26之间，遗传距离为3. 6 cM (厘摩；图2a)。
[0031] 位点电子物理图谱的构建：为了构建该位点的物理图谱，将上述连锁 标记通过生物信息学分析，利用稻癌病菌数据库软件BLASTN(http://www. broad, mit. edu/ annotation/genome/magnaporthe_grisea/Blast. html)着陆于参考菌株 70-15 的基因组 序列（http://www. broad, mit. edu)上。结果表明，位点被物理定位在大约33 kb的 区域内（图2b)。
[0032] (3) 位点重叠群的构建：根据上述连锁标记锚定的参考菌株70-15的BAC 文库（http://www. broad, mit. edu),由此构建了 位点的重叠群（图 2c)。
[0033] UWKTftl候选基因的预测以及精细电子物理图谱的构建： 为了确定的候选基因，利用菌株70-15的参考序列，通过2个基因注释系统 Broad Magnaporthe grisea Database (http://www. broad, mit. edu/annotation/genome/ magnaporthe_grisea/Regions. html)和 Softberry FGENESH 2.6(http://www. softberry. com/berry. phtml)对目的基因区域进行基因预测及注释分析。结果表明，其间存在3个编 码分泌蛋白的基因。为了进一步确定候选基因，其间开发了 1个SSR标记（MS6-34)，以及3 个候选无毒基因标记（candidate avirulence gene，CAG)进行了连锁分析。结果表明，这4 个标记皆与JKrftTM立点完全共分离(无重组体）（图2d)。因此，对3个候选基因都进行了 遗传互补分析(下述)。
[0034] ( 5 ) J KTftl候选基因的克隆及其遗传转化： 根据参考菌株70-15序列设计3个候选基因的PCR引物： blF: TTGGCGCGCCCGTTTGGTTACGTTCACCCTTG ； bIR: TAGGCGCGCCTCGACTACATCCCCATGACGC ； b2F: TTGGCGCGCCGCCATCAACGAGACCACAGCCCAC ； b2R: TTGGCGCGCCACTGCGGGAATGCCGACAATGCGAG ； b3F: ATGGCGCGCCCGTTTGGTTACGTTCACCCTTG ； b3R: TAGGCGCGCC ACTGCGGGAATGCCGACAATGCGAG ； 下划线为用于连接双元转化载体pBHt2的限制性内切酶Asc J的作用序列。
[0035] 然后，利用高保真（high fidelity，HF) PCR技术从供体菌株CHL42基因组DNA中 扩增了 3个候选基因的片段，其中，bl和b2分别包含2个候选基因；b3则包含中间的1个 候选基因。
[0036] PCR扩增的体系如下：
【权利要求】
1. 一种稻瘟病菌无毒基因蛋白，其特征在于，具有如下序列： (1) SEQ ID NO :3,或， (2) 序列（1)经替换、缺失、或/和添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有同等功能 的氨基酸序列、功能片段和/或突变体。
2. -种稻瘟病菌无毒基因其特征在于，其核苷酸具有如下序列： (1) SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2,或， (2) 序列（1)经替换、缺失和/或添加一个或多个核苷酸且与权利要求1所述基因所编 码的蛋白具有同等功能的基因序列。
3. 含有权利要求2所述基因的载体。
4. 含有权利要求3所述载体的重组体。
5. 权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在制备植物分子农药中的应用。
6. 权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在培育植物抗病新品种中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述基因或含所述基因的载体与相应 的抗病基因或载体共价导入植物中培育抗病新品种。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为禾本科作物。
【文档编号】A01H5/00GK104356213SQ201410569294
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】潘庆华, 张树林, 何丽云, 杨先锋, 王玲 申请人:华南农业大学