一种新型毛叶茶无色花青素还原酶lar2及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种来源于毛叶茶的新型的无色花青素酶及其编码序列 CpLAR2 。发明人将毛叶茶中分离得到的 CpLAR2 基因和pET28a(+)载体构建重组表达载体后转入大肠杆菌BL21菌株中，并进行诱导表达，最终检测到 CpLAR2 基因在大肠杆菌中的高效表达。本发明涉及的蛋白及其编码序列是一种新型的无色花青素还原酶及其编码基因，本发明对植物儿茶素合成及其调控机制的研究，尤其是反式儿茶素的积累机制具有重要的理论和实际意义，将为进一步培育反式儿茶素为主的茶品种奠定理论基础，应用前景广阔。
【专利说明】—种新型毛叶茶无色花青素还原酶LAR2及其编码基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和基因工程领域中毛叶茶ptilophylIa)无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase, LAR2)、其编码基因、包含该基因的重组表达载体及其转化体。
【背景技术】
[0002]毛叶茶{Camellia ptilophylla Chang)是中山大学张宏达教授于80年代在广东境内发现的一种天然无咖啡碱茶种质资源，又称可可茶。它与传统茶(C sinensis (L.)0.Ktze.& C.assamica var.kucha Chang et Wang)的主要儿茶素成分呈现手性对称:传统茶以顺式的表儿茶素为主，即表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)_印igallocatechin-3-gallate, EGCG]、表没食子儿茶素[(-)-epigallocatechin, EGC]、表儿茶素没食子酸酯[(-)-epicatechin _3 -gallate, ECG]、表儿茶素[(-)-epicatechin, EC]等；而毛叶茶以反式的儿茶素为主，即没食子儿茶素没食子酸酯[(+)-gallocatechin-3-gallate，GCG]、没食子儿茶素[(+)-gallocatechin, GC], [ (+) -catechin-3-gallate, CG]、儿茶素[(+) -catechin, C]等。
[0003]儿茶素是茶叶中重要的多酚类次生代谢产物，是茶叶苦和涩的味道的主要来源，同时影响茶叶香气物质的表现，研究表明儿茶素具有重要的保健功能。目前，顺式儿茶素EGCG是茶叶中公认的的抗氧化成分，然而现有研究已经证实，反式儿茶素在抗过敏、对环氧酶和酪氨酸酶等许多酶的抑制作用、清除自由基活性等方面的生理活性要强于顺式儿茶素EGCG，并被发现具有独特的美白、抗良性前列腺增生、抗病毒、抑制胆固醇吸收、抑制破骨细胞形成等活性。
[0004]儿茶素合成途径中，无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase, LAR)催化无色花青素转变为反式儿茶素C和GC。通过对毛叶茶转录组数据的分析，我们发现毛叶茶除了无色花青素还原酶LARl与茶的LAR高度同源外，还存在另外一种新型的无色花青素还原酶LAR2，因此本发明通过对毛叶茶LAR2基因的克隆，构建重组表达载体，进行原核表达，最终获得目的表达蛋白，这将为成功揭示反式儿茶素的合成机制提供有力证据。
【发明内容】
[0005]本发明的毛叶茶ZAC基因由1197个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框，开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，为序列表中的SEQ.1D.NO:1序列，将此基因命名为CpLAR2。
[0006]本发明的毛叶茶LAR2蛋白由399个氨基酸组成，为序列表中的SEQ.1D.N0:2序列，毛叶茶LAR2蛋白的理论分子量为43.4Da，等电点为5.25。
[0007]含有上述SEQ.1D.NO:1序列及其开放阅读框架的多核苷酸的载体，以及用上述SEQ.1D.NO:1序列及其开放阅读框架的多核苷酸转化的生物细胞，均是本发明需要保护的内容。
[0008]本发明基因的发现，使通过基因调控来控制反式儿茶素合成成为可能，对于培育反式儿茶素为主的茶种质资源具有重要意义。
[0009]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0010]【专利附图】
【附图说明】:
图1为毛叶茶嫩叶总RNA
图2为CpLAR2基因全长PCR扩增产物
图3为不同植物无色花青素还原酶序列比对图
图4为原核表达载体pET-28a-CpLAR2的构建流程图
图5为载体pET-28a-CpLAR2的酶切图谱
图6为大肠杆菌中CpLAR2表达产物的Western Blot分析
【具体实施方式】
[0011]以下实施例、实验例仅对本发明进行进一步的说明，不应构成对本发明的进一步的限制。
[0012]实施例1、CpLAR2基因的克隆克隆，具体步骤如下:
毛叶茶产自广东省惠州市象头山，移植于江苏省中科院植物研究所种植圃，成活后，与生长旺盛期采集鲜叶叶片，液氮速冻后用于总RNA的提取，总RNA经过反转录合成cDNA，cDNA进行特异弓I物PCR反应，最终获得CpLAR2基因。
[0013]1、毛叶茶总RNA的提取和cDNA反转录
利用B1teke公司的多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒提取毛叶茶总RNA，电泳检测结果如图1 所不。总 RNA 通过 Takara 公司 PrimeScript ? 1st Strand cDNA Synthesis反转录为cDNA。
[0014]2、PCR 反应
以上述得到的毛叶茶cDNA为模版，以分别带有及^ I与通ο I酶切位点的petLAR2_F:(5/ -CCGAATTCATGACTATAGCAGCAGAA GTA-3')(下划线为 I)与 petLAR2_R:(5/ -CCGCTCGAGTCATGAACAAGT GGTGGTGAT-3 ')(下划线为通ο I)为引物，按以下反应扩增出似基因。50 μ I反应体系如下:cDNA 模版2.0 μ I (5.θμδ)
10 X PCR Buffer (含 Mg2+) 5.0 μ I
dNTP4.0 μ I (10 mM each)
引物 petLAR2_F (10 μ mo I.L-1)2.0 μ I
2.0 μ I
ExTaq DNA polymerase0.5 μ I (5 U/M-l)
ddH2034.5 μ I
按以下程序进行扩增反应:先94°C预变性5 min ;然后94°C变性45 sec，55°C退火45sec，72°C延伸I min，35个循环；最后72°C延伸8 min。电泳检测PCR产物，如图2所示，有一条带大小约100bp,与理论值相符。
[0015]通过切胶回收100bp左右的目的条带，将该DNA片段连接到pMD19_T载体上，构建pMD-CpLAR2重组载体，转化到大肠杆菌DH5 α菌株，经测序后在GenBank中(http: //blast, st-va.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行 Blastn 比较，结果显不，公共数据库中与CpLAR2同源性较高的序列不多,包含完整Q)S的仅蔷薇科巴旦木persica,XM_007208737)，两者同源性也仅为60.9%，因此表明已分离得到毛叶茶的ZWP基因，且是一种新型的无色花青素还原酶编码基因。
[0016]实施例2、CpLAR2的表达分析
为了表明CpLAR2基因的编码功能，本发明将CpLAR2基因克隆到Novagen公司的pET-28a (含His-Taq)的及^7? I与通ο I位点之间，并转化到大肠杆菌BL21菌株中，获得了高效表达。
[0017]1、毛叶茶LAR2 二级结构和保守motif分析
利用 PredictProtein (https://www.predictprotein.0rg/)对 CpLAR2 的二级结构进行预测，结果显示该蛋白包含30.90%的α螺旋，14.82%的β折叠以及54.27%的卷曲。
[0018]将毛叶茶LAR2 和条{Camellia sinenesis, ADZ58167)、柿 CZ7/0577JTOS kaki,BAH89267),兔眼蓝毒(應 ashei, BAM42674), 口」_ 口」_ (Theobroma cacao, ADD51357),葡萄(Kiii1S viniferal, CAI26309),毛果杨iricAocarpa, XP_002312379),巴^LifXPrunus persica, XP_007208799)等无色花青素还原酶序列进行Gen1us软件联配后发现，虽然这些物种的无色花青素还原酶序列发生了分化，但是都存在如图3所示保守moitf =RFLP (123?126aa)、ICCN (166?169aa)和 THD (282?284aa)。
[0019]二、CpLAR2在大肠杆菌中的高效表达
本发明是利用Novagen公司的pET_28a(+)高效表达载体的多克隆位点来实现CpLAR的高效表达的。本实验采用的酶切位点使pET-28a(+)表达载体表达出的产物5’端附加6个连续His的融合蛋白，这6个连续的His构成了 1-NTA凝胶特异结合的位点，因此可利用亲和层析来纯化表达产物。具体步骤如下:
1.pET-28a-CpLAR2重组载体构建
将携带CpLAR2基因的pMD-CpLAR2重组载体与pET_28a (+)表达载体用相同的限制性内切酶I与通ο I)酶切后，T4连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21菌株，并用添加了终浓度为50 μ g/μ L卡那霉素的LB培养基上培养并选择。载体的构建流程见图4。经质粒酶切鉴定(如图5所示)，1，2为质粒pET-28a-CpLAR用EcoR I与通ο I酶切后，再经过PCR鉴定后，将筛出的连接正确的重组子进行测序，证明插入载体的DNA序列的阅读框架是正确的。把构建的带有②“似基因的重组表达载体，命名为pET-28a-CpLAR2，用于诱导表达分析。
[0020]2.CpLAR2 诱导表达
将筛选并经鉴定确认的重组子，接种到含卡那霉素(终浓度为50μ g/μ L)的LB液体培养基中，37°c下振荡培养过夜后，按1:50 (K/K)转入新的培养基继续培养，待菌液0D_为0.5左右时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至lmmol/L，以pET_28a空载体为对照，28°C进行诱导表达，培养3h收集菌体，提取细胞总蛋白，然后用HisBind resin纯化并进行10%SDS-PAGE电泳检测，结果如图6所示，从图中可以看出，CpLAR2在pET_28a中得到了高效表达。
【权利要求】
1.一种新型的无色花青素还原酶，是具有SEQ ID N0.2氨基酸残基序列之一的蛋白质。
2.根据权利要求1所述无色花青素还原酶的编码基因，其特征在于所述脂肪酸延长酶的基因cDNA为下述核苷酸序列之一: Ca)是具有SEQ ID N0.1的核苷酸序列； (b)与多核苷酸(a)互补的核苷酸序列； (c)编码序列表中SEQID N0.2氨基酸残基序列的核苷酸序列。
3.扩增权利要求2所述序列的引物对petLAR2_F和petLAR2_R，其特征在于包括具有序列表SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4的核苷酸序列。
4.含有权利要求2任一所述的基因的重组表达载体。
5.含有权利要求2任一所述的基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求2任一所述的基因的工程菌。
7.权利要求1任一所述的蛋白在培育反式儿茶素改良植物中的应用。
8.权利要求2任一所述的基因在培育反式儿茶素改良植物中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK104357411SQ201410628470
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】李密密, 温尧林, 杭悦宇, 渠艳秋 申请人:江苏省中国科学院植物研究所, 江苏凯吉生物科技有限公司