一种能促进罗非鱼生长激素表达的多肽pp3及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于多肽功能研究【技术领域】，具体公开了一种能促进罗非鱼生长激素表达的多肽PP3及其应用，多肽PP3的氨基酸序列为HYINLITR。采用该多肽PP3的溶解液腹腔注射罗非鱼，结果显示PP3能够显著促进罗非鱼脑垂体中生长激素的表达水平，具有生理活性。利用本发明的多肽PP3可以制备用以提高垂体GHmRNA表达的口服制剂或制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂。
【专利说明】一种能促进罗非鱼生长激素表达的多肽PP3及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于多肽功能研究【技术领域】，具体涉及一种能促进罗非鱼生长激素表达的多肽PP3及其应用，所述应用具体为多肽在促进罗非鱼幼鱼生长中的应用。
【背景技术】
[0002]罗非鱼俗称福寿鱼，属丽鱼科(Cichlidae),罗非鱼属(Oreochromis)。罗非鱼具有食性杂、耐低氧、繁殖力强等特点，目前已成为世界水产业重要的养殖鱼类，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。
[0003]罗非鱼在国际市场的需求量不断增加，在全球鱼类贸易中，罗非鱼占第3位，仅次于鲑鱼和鳟鱼，具有极高的经济价值。随着养殖和出口规模的不断扩大，对饵料配置的要求也不断提高，由于饲料成本不断增加，研究趋向于以植物蛋白代替鱼粉来减少成本。但是鱼类摄入植物蛋白饲料，会出现摄食量减少、体重减轻的现象。因此，近年来在罗非鱼产业界的一个重要研究课题就是，如何采用分子生物学手段，深入研究罗非鱼摄食、消化与营养吸收和生长的调控机制，根据研究的结果，研究开发生物功能性产品如多肽等，并进一步作为饲料添加剂产品应用于罗非鱼养殖。这种产品对于促进罗非鱼摄食，提高消化吸收效率，增强鱼肉品质，调节生长速率，从而取得更大的经济效益有着重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了解决投喂罗非鱼植物蛋白饲料时，会出现摄食量减少、体重减轻的问题，提供一种能促进罗非鱼生长激素表达，从而促进罗非鱼生长的多肽。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种生物活性多肽产品在罗非鱼养殖中的应用。
[0006]为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的:
本发明通过分析罗非鱼消化系统中消化产物组分，对其中重要的多肽片段组分的生理功能进行研究，首次发现了一种可以促进罗非鱼生长激素表达的多肽PP3，该多肽的氨基酸序列为HYINLITR。
[0007]通过生物合成的方法可以制备大量的多肽产品，将多肽作为罗非鱼鱼苗的饲料添加剂去喂养罗非鱼，从而研究多肽PP3的生物学功能，结果发现:多肽PP3可以显著促进罗非鱼生长激素表达，从而促进罗非鱼的生长。
[0008]因此，本发明要求保护多肽PP3在制备提高罗非鱼垂体GH mRNA表达制剂中的应用，以及多肽PP3在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。
[0009]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明通过分析罗非鱼消化系统中消化产物组分，对其中重要的多肽片段组分的生理功能进行研究，首次发现了一种可以促进罗非鱼生长激素表达的多肽PP3，将该多肽作为罗非鱼幼苗的饲料添加剂，可以显著促进罗非鱼的生长，在罗非鱼的养殖中具有很好的应用前景。
[0010]【专利附图】
【附图说明】图1是罗非鱼神消化道酶解产物的总离子流图。
[0011]图2是酶解片段PP3的质谱图。
[0012]图3是腹腔注射阳性对照蛋白后2h三种剂量对罗非鱼垂体GH mRNA表达的影响；其中表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05 ;NC代表阴性对照；P_L代表阳性对照蛋白低剂量组；P-M代表阳性对照蛋白中剂量组；P-H代表阳性对照蛋白高剂量组。
[0013]图4是腹腔注射阳性对照蛋白后6h三种剂量对罗非鱼垂体GH mRNA表达的影响；其中表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05 ;NC代表阴性对照；P_L代表阳性对照蛋白低剂量组；P-M代表阳性对照蛋白中剂量组；P-H代表阳性对照蛋白高剂量组。
[0014]图5是腹腔注射酶解片段PP3后2h三种剂量对罗非鱼垂体GH mRNA表达的影响；其中表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05 ；NC代表阴性对照；Y4-L代表PP3多肽低剂量组；Y4-M代表PP3多肽中剂量组；Y4-H代表PP3多肽高剂量组。
[0015]图6是腹腔注射酶解片段PP3后6h三种剂量对罗非鱼垂体GH mRNA表达的影响；其中表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05 ；NC代表阴性对照；Y4-L代表PP3多肽低剂量组；Y4-M代表PP3多肽中剂量组；Y4-H代表PP3多肽高剂量组。
[0016]图7是腹腔注射阳性对照蛋白后2h三种剂量对罗非鱼垂体GH mRNA表达的影响；其中表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05 ;NC代表阴性对照；P_L代表阳性对照蛋白低剂量组；P-M代表阳性对照蛋白中剂量组；P-H代表阳性对照蛋白高剂量组。
[0017]图8是腹腔注射多肽PP3后a三种剂量对罗非鱼垂体GH mRNA表达的影响；其中表示与对照组相比有显著性差异，P < 0.05 ；NC代表阴性对照；Y4-L代表PP3多肽低剂量组；Y4-M代表PP3多肽中剂量组；Y4-H代表PP3多肽高剂量组。
[0018]
【具体实施方式】
下面结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。除非特别说明，实施例中采用的试剂、方法和设备均为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0019]除非特别说明，以下实施例所用饲料、试剂和材料均为市购。
[0020]实施例1:罗非鱼消化道酶解产物的分析
选择体重50 ±2克体重均一的罗非鱼分组进行投喂商品化配合饲料，适应期为7天，每天9:00饱食投喂，第4天进行提取样品。投喂后分1.0、1.5、3.0、6.0、9.0、12.0、24.0小时6个时段，每个时段两条鱼，所有的样品均将两条鱼的量混合在一起。每个时段先用注射器从鱼的尾静脉抽血，将血液全部抽提，注入按1/10用PBS溶解的3.8%(w / v)柠檬酸三钠中。然后解剖罗非鱼，取胃肠道，用生理盐水冲洗，罗非鱼胃分为贲门、幽门盲囊和幽门，肠道分为十二指肠(胃的幽门部到肠道螺旋部分)、前肠(肠道螺旋部分)，前肠每10厘米(依具体情况而定)为一段，后肠(螺旋末端到示瓣收缩区)，按段用绳子扎紧各个部分，用剪刀剪开一个小口获取各个部分的消化液。将消化液注入有一定结合缓冲液(0.5M NaCl, 20mMTriS-Hcl，5mM咪唑，pH 7.9)的离心管中，立即插冰上。消化液取完之后涡旋混匀，每个时段样品保存待处理。
[0021]消化液蛋白处理方法:预实验:消化液离心(转速2000rpm),看沉淀量，加大结合缓冲液的量，涡旋，静置10分钟，2000rpm离心，直到沉淀量不再减少为止(保证蛋白基本溶解)，摸索溶解消化液的结合缓冲液量。正式实验:取样时用结合缓冲液溶解蛋白，第二天12000g、10 min、4°C离心得上清。样品保存于_20度。高效液相色谱质谱检测罗非鱼消化道酶解样品。检测通过先将样品进行液相分离，然后对分离的样品进行质谱检测，结果如图1，在10.96min时检测到酶解片段PP3，酶解片段PP3进行质谱检测确定氨基酸序列为HYINLITR。
[0022]实施例2:罗非鱼酶解片段PP3的功能研究-腹腔注射罗非鱼幼鱼
根据质谱检测所获得的序列通过化学合成，制备了多肽PP3。用PBS缓冲液溶解PP3和阳性对照蛋白(NPY即神经肽Y)，对罗非鱼幼鱼进行腹腔注射。实验分为阴性对照组(PBS缓冲液)，PP3和阳性对照蛋白高剂量组(0.24nmol/gbw),PP3和阳性对照蛋白中剂量组(0.12nmol/gbw)以及PP3和阳性对照蛋白低剂量组(0.024nmol/gbw),每组10尾鱼。在注射后分别在2h、6h将鱼用丁香酚麻醉，取垂体组织于液氮中，然后再转入_80°C冰箱保存待用。按照invitrogen公司的Trizol reagent使用说明书提取RNA, Τ0Υ0Β0公司的ReverTraAce - α - TM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行反转录，Τ0Υ0Β0 公司 KODSYBR?qPCR Mix的使用说明书进行荧光定量PCR检测垂体GH mRNA表达水平的变化。然后使用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果见图3、图4与图5、图6，显示腹腔注射阳性对照蛋白2h高剂量和6h低剂量均能显著促进垂体GH mRNA表达，PP3在2h高剂量能显著促进垂体GH mRNA表达，说明多肽PP3具有生理功能。
[0023]实施例3:多肽PP3的功能研究-重复腹腔注射罗非鱼幼鱼
根据第一次腹腔注射结果，PP3和阳性对照蛋白在注射后2h能够较大程度的促进GHmRNA表达，因此重复进行注射实验，重点关注注射2h取样检测对GH mRNA表达影响。实验分别为阴性对照组，PP3和阳性对照蛋白高剂量组(0.24nmol/gbw), PP3和阳性对照蛋白中剂量组(0.12nmol/gbw)以及PP3和阳性对照蛋白低剂量组(0.024nmol/gbw),每组15尾鱼。在注射后2h将鱼用丁香酚麻醉，取垂体组织于液氮中，然后再转入_80°C冰箱保存待用。按照invitrogen公司的Trizol reagent使用说明书提取RNA, Τ0Υ0Β0公司的ReverTraAce - α - TM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行反转录，Τ0Υ0Β0 公司 KODSYBR?qPCR Mix的使用说明书进行荧光定量PCR检测垂体GH mRNA表达水平的变化。然后使用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果见图7和图8，显示腹腔注射阳性对照蛋白高剂量2h能显著促进垂体GH mRNA表达，多肽PP3在2h高剂量能显著促进垂体GH mRNA表达，两次腹腔注射结果显示实验具有良好的重复性、可靠性，多肽PP3是有生理功能的多肽。
【权利要求】
1.一种人工合成多肽PP3，其特征在于，所述多肽PP3的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所/Jn ο
2.权利要求1所述多肽PP3在制备提高罗非鱼垂体GHmRNA表达制剂中的应用。
3.权利要求1所述多肽PP3在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。
【文档编号】A23K1/16GK104371005SQ201410650573
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】李文笙, 吴阿敏 申请人:中山大学