一种金果榄叶片成苗的快速繁育方法
【专利摘要】一种金果榄叶片成苗的快速繁育方法，包括如下步骤：(1)取金果榄无菌试管苗的幼嫩叶片，用解剖刀在叶背面以#字形划伤后置于MS繁殖培养基中培养，诱导愈伤形成，并分化获得丛生芽；(2)将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株；(3)将所述健壮植株置于1/2MS生根培养基中培养得到完整的带根苗。采用本发明所述的培养方法得到的金果榄丛生芽增殖系数达到20-30倍，获得的组培苗生根率在95％以上，移栽苗床成活率在90％以上，有效解决了金果榄的规模化育苗问题。
【专利说明】一种金果榄叶片成苗的快速繁育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种金果榄叶片成苗的快速繁育方法。
【背景技术】
[0002]金果榄(Tinospora capillipes Gagnep.)为防己科青牛胆属缠绕藤本植物，药用部位为其干燥块根，是《中国药典》收载中药金果榄的基源植物之一。具有清热解毒、利咽止痛的功效，主治内服用于治疗各种炎症、如咽喉肿痛、扁桃体炎、急性胃肠炎、菌痢、痈肿疔疖等；外用浸膏、磨汁涂搽或研末调搽，用以治疗静脉炎、毒蛇咬伤等症。主产于广西、江西、湖北、湖南等地，是常用中药，块根含掌叶防己碱和咖伦宾、巴马汀、药根碱、非洲防己碱、千金藤碱、蝙蝠葛碱和木兰花碱。药理研宄表明金果榄有明显的抗炎镇痛作用、抗菌作用、抗肿瘤、降低血糖、抗应激作用、抗溃疡作用及解毒等，被喻为能替代抗生素的首选中药而倍受青睐。
[0003]目前金果榄药材主要来源于野生资源。由于市场对药材的需求量大幅度增加，造成野生资源的过度采挖，野生资源趋于匮乏。在自然条件下，金果榄零星生长于石灰岩的石隙石缝间，地上部分则沿石缝向上攀援于岩石或林木茎干上，生长极为缓慢。同时金果榄为雌雄异株植物，自然结实率低，自然繁殖率低，种子种苗稀缺，资源更新非常困难。虽然也有科研工作者对金果榄的扦插繁殖技术进行一定程度的研宄，但效果不是十分明显，无法满足人工栽培的需要。而采用生物技术组织培养技术，可以有效快速地提高金果榄种苗的繁殖速度和质量，实现金果榄优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种金果榄叶片成苗的快速繁育方法，它能够快速繁殖出大量适合移栽的优良金果榄种苗、满足生产需要。
[0005]本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种金果榄叶片成苗的快速繁育方法，包括以下步骤:
[0006](1)叶片分化繁殖获得丛生芽:取金果榄无菌试管苗的幼嫩叶片，用解剖刀在叶片背面以#字形划伤后平铺在MS繁殖培养基上，在培养温度23-27°C，光照强度lOOOlux，光照时间为6-8小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入0.5-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6_BA、0.1-0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、0.l-ο.5mg/LTDZ甲硫达嗪、1.0mg/LGA3赤霉素、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为 4.0-4.5 ；
[0007](2)丛生芽壮苗培养:将步骤(1)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入0.1-1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、2.0-4.0mg/L 的萘乙酸 NAA、0.1-0.3mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸 2，4_D、30g/L 蔗糖和
3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.0-4.5 ；
[0008](3)健壮植株生根培养:将步骤⑷中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基为1/2MS基本培养基中加入1.5-4.0mg/L的萘乙酸NAA、0.2-0.8mg/L的6-苄基腺嘌呤6_BA、20g/L香蕉泥、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0009]本发明的突出优点在于:
[0010](1)采用生物技术对金果榄进行组织培养快速繁殖，通过金果榄丛生芽的繁殖，在短时间内可培育出大量适合栽培种植的金果榄幼苗，显著提高了金果榄种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
[0011](2)通过幼嫩叶片为外植体诱导分化获得大量的丛生芽，为金果榄组培苗的获得提供了新的途径，也为珍稀濒藤本植物组培苗的获取提供新途径。
[0012](3)采用本发明所述的培养方法得到的金果榄丛生芽增殖系数达到25-35倍，丛生芽经过复壮后，接种到含有生根粉NAA、BA与香蕉泥的生根培养基上，获得的组培苗生根率在95 %以上，移栽苗床成活率在95 %以上；快速、便捷、高效地进行金果榄组织培养，实现金果榄组培种苗的规模化生产。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
[0014]实施例1
[0015]本发明所述的金果榄叶片成苗的快速繁育方法的一个实例，包括以下步骤:
[0016](1)叶片分化繁殖获得丛生芽:取金果榄无菌试管苗的幼嫩叶片，用解剖刀在叶片背面以#字形划伤后平铺在MS繁殖培养基上，在培养温度23-27°C，光照强度lOOOlux，光照时间为6-8小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、0.lmg/LTDZ甲硫达嗪、1.0mg/LGA3赤霉素、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.0，丛生芽增殖系数为26.4 ；
[0017](2)丛生芽壮苗培养:将步骤(1)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入0.lmg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、4.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.3mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸2，4_D、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.0 ;丛生芽再次增殖的系数为3.2 ;
[0018](3)健壮植株生根培养:将步骤⑷中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基为1/2MS基本培养基中加入1.5mg/L的萘乙酸NAA、0.8mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、20g/L香蕉泥、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，生根率为92.7%。
[0019]实施例2
[0020]本发明所述的金果榄叶片成苗的快速繁育方法的另一个实例，包括以下步骤:
[0021](1)叶片分化繁殖获得丛生芽:取金果榄无菌试管苗的幼嫩叶片，用解剖刀在叶片背面以#字形划伤后平铺在MS繁殖培养基上，在培养温度23-27°C，光照强度lOOOlux，光照时间为6-8小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.25mg/L的吲哚丁酸IBA、0.5mg/LTDZ甲硫达嗪、1.0mg/LGA3赤霉素、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.2，丛生芽增殖系数为28.6 ；
[0022](2)丛生芽壮苗培养:将步骤(1)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、
4.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸2，4_D、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.2 ;丛生芽再次增殖的系数为4.1 ;
[0023](3)健壮植株生根培养:将步骤⑷中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基为1/2MS基本培养基中加入2.5mg/L的萘乙酸NAA、0.4mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、20g/L香蕉泥、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，生根率为96.2%。
[0024]实施例3
[0025]本发明所述的金果榄叶片成苗的快速繁育方法的再一个实例，包括以下步骤:
[0026](1)叶片分化繁殖获得丛生芽:取金果榄无菌试管苗的幼嫩叶片，用解剖刀在叶片背面以#字形划伤后平铺在MS繁殖培养基上，在培养温度23-27°C，光照强度lOOOlux，光照时间为6-8小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、0.25mg/LTDZ甲硫达嗪、1.0mg/LGA3赤霉素、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.3，丛生芽增殖系数为32.8 ；
[0027](2)丛生芽壮苗培养:将步骤(1)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、2.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.lmg/L的2，4-二氯苯氧乙酸2，4_D、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.3 ;丛生芽再次增殖的系数为4.7 ;
[0028](3)健壮植株生根培养:将步骤⑷中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基为1/2MS基本培养基中加入4.0mg/L的萘乙酸NAA、0.2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、20g/L香蕉泥、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，生根率为95.3%。
[0029]实施例4
[0030]本发明所述的金果榄叶片成苗的快速繁育方法的又一个实例，包括以下步骤:
[0031](1)叶片分化繁殖获得丛生芽:取金果榄无菌试管苗的幼嫩叶片，用解剖刀在叶片背面以#字形划伤后平铺在MS繁殖培养基上，在培养温度23-27°C，光照强度lOOOlux，光照时间为6-8小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.lmg/L的吲哚丁酸IBA、0.25mg/LTDZ甲硫达嗪、1.0mg/LGA3赤霉素、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.5，丛生芽增殖系数为30.5 ；
[0032](2)丛生芽壮苗培养:将步骤(1)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入0.55mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、3.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸2，4_D、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.5 ;丛生芽再次增殖的系数为4.0 ;
[0033](3)健壮植株生根培养:将步骤⑷中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基为1/2MS基本培养基中加入3.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、20g/L香蕉泥、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，生根率为92.3%。
【权利要求】
1.一种金果榄叶片成苗的快速繁育方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)叶片分化繁殖获得丛生芽:取金果榄无菌试管苗的幼嫩叶片，用解剖刀在叶片背面以#字形划伤后平铺在MS繁殖培养基上，在培养温度23-27°C，光照强度lOOOlux，光照时间为6-8小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入0.5-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6_BA、0.1-0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、.0.1-0.5mg/LTDZ甲硫达嗪、1.0mg/LGA3赤霉素、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为 4.0-4.5 ； (2)丛生芽壮苗培养:将步骤(I)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20天得到健壮植株，其中MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入0.1-1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、.2.0-4.0mg/L 的萘乙酸 NAA,0.1-0.3mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸 2，4_D、30g/L 蔗糖和 3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为4.0-4.5 ； (3)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基为1/2MS基本培养基中加入1.5-4.0mg/L的萘乙酸NAA、.0.2-0.8mg/L的6-苄基腺嘌呤6_BA、20g/L香蕉泥、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
【文档编号】A01H4/00GK104472364SQ201410737169
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】王晓峰, 韦坤华, 缪剑华, 李林轩, 李翠, 韦莹, 王一诺, 冯世鑫 申请人:广西壮族自治区药用植物园