杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种远缘杂交育种和杂交种子无菌播种繁殖的方法，特别指一种杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法。
【背景技术】
[0002]杂交兰(Hybrid Cymbidium)是国兰与大花蕙兰种间杂交培育而成的兰花新种类，集国兰的植株小巧、幽香、典雅和大花蕙兰的花大、色纯靓丽等特性，花期长，有花观花、无花观叶，具有较高的观赏和经济价值，成为了近几年来年宵及日常消费市场的新宠，消费份额逐年增长，市场潜力巨大。
[0003]西藏虎头兰(Cymbidium tracyanum L.)是兰科兰属附生类多年生草本植物。原产我国贵州西南部、四川、云南西南部至东南部和西藏东南部，缅甸、泰国也有分布，现广泛栽培。叶长碧绿，花姿粗旷，色彩鲜艳，花型整齐且质地坚挺，经久不凋，具香味，抗逆性强，是世界著名的兰花新星。
[0004]兰属(Cymbidium)的种间远缘杂交存在亲和障碍，种间杂种胚通常发育不良、无胚乳，杂交种子在自然条件下萌发困难，不易成苗，通过无菌播种人工培养，能够在短期内获得大量幼小植株。然而不同杂种胚的萌发差异较大，直接影响了兰属种间远缘杂交育种效率。近年来，国内已有部分兰属种间杂交研究的报道，但建立的技术重复性差。因此，深入研究不同类型兰属植物种间杂交种子的萌发与发育特性，将为进一步开展兰属新品种培育奠定基础。
[0005]鉴于消费者对“新、奇、特、香”兰花新优品种的追求，培育更多具有自主知识产权的兰花新品种是植物育种界研究的一个热门课题。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题，在于提供一种杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法。
[0007]本发明是这样实现的:一种杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法，包括以下步骤:
[0008](I)人工授粉:以杂交兰‘台北小姐’为母本，西藏虎头兰为父本进行杂交，取母本开花后2?4d的花朵，用消毒过的镊子去除唇瓣及柱头上的花粉块，取父本完全张开的花朵的花粉块置放于母本柱头蕊腔内；剪取授粉205d后未开裂的成熟蒴果进行无菌播种；
[0009](2)果荚预处理与种子播种:
[0010]将成熟蒴果进行预处理，然后将成熟蒴果的种子播种于萌发培养基中；所述萌发培养基为 1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1.0g/L+琼脂5.8g/L；
[0011](3)种子萌发:将种子接种于所述萌发培养基中培养，培养温度为25±2°C，光照强度 1200Lux 土 100，光照时间 12h/d ；
[0012](4)根状茎的增殖与分化培养:选择生长状态相近的种子萌发形成的根状茎，在无菌条件下分切成长0.6?0.8cm的切段，接种于1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖20g/L+活性炭1.5g/L+琼脂5.8g/L的增殖与分化培养基中培养，培养温度25 ± 2°C，光照强度1500Lux ± 100，光照时间12h/d ；
[0013](5)壮苗生根培养:将根状茎分化形成的2.5?3.5cm的幼苗小心切下，分选后剪除老根，仅留I?2条短嫩新根，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA2.0mg/L+鹿糖25g/L+香蕉泥100g/L+活性炭2.5g/L+琼脂5.8g/L的生根壮苗培养基中培养，培养温度25 ± 2°C，光照强度1500Lux 土 100，光照时间 12h/d ；
[0014](6)炼苗移栽:待生根苗长至6.0?7.0cm、叶片3?4片、根3?4条时，将瓶苗从培养室移至温室大棚，进行炼苗，继续生长30d，温室大棚遮光率60%，温度保持25 ±2°C，空气湿度保持60%?70%;
[0015]出瓶种植前3?5d，打开瓶盖适应外界环境，然后取出小苗，洗净根部培养基，用50 %多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释溶液浸泡3min，阴凉处自然晾干后种植于发酵过的基质中，用恶霉灵溶液喷灌植株及植料；2d后浇透水，以后按预定周期进行叶面喷水和喷洒
0.1 %多囷灵杀囷剂ο
[0016]进一步地，所述步骤(2)中，将成熟蒴果进行预处理的具体方法如下:
[0017]将成熟蒴果置于流水下冲洗3min，用牙刷沾洗洁精仔细刷洗表皮，用手术刀剔除柱头、残留的枯瓣及表皮病虫斑，再用75 %酒精擦拭;放入I %NaC10溶液浸泡15min，再用超声波清洗器震荡5?lOmin，移到超静工作台上，用消毒过的镊子取出蒴果，用无菌水清洗2次;夹取蒴果沾上75%酒精后在酒精灯上点燃消毒10s。
[0018]进一步地，所述步骤(2)中，将成熟蒴果的种子播种于萌发培养基中的具体操作方法如下:
[0019]用手指捏住成熟蒴果的果柄，使蒴果朝风口而手在后，另一手持消毒过的手术刀将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于萌发培养基表面;或将消毒过的种子移入有无菌水的培养瓶中摇匀，然后用无菌吸管吸取Iml摇匀悬浮液均匀滴到萌发培养基面上。
[0020]进一步地，所述基质包括质量比为2:1的树皮和碎石子。
[0021 ]本发明的优点在于:种子萌发快，萌发率高，根状茎分化成苗时间短，能快速地获得大量试管苗;种苗质量高，成苗移栽成活率达97.8%,为杂交兰种苗的规模化生产提供了一条有效的新途径。
【具体实施方式】
[0022]本发明采用杂交兰‘台北小姐’为母本，野生驯化的西藏虎头兰为父本，进行种间杂交种子无菌播种和种苗繁殖，具体步骤如下:
[0023](I)人工授粉:以杂交兰‘台北小姐’为母本，西藏虎头兰为父本进行杂交，在12月初两亲本同时开花时，取母本开花后2?4d的花朵，用消毒过的镊子去除唇瓣及柱头上的花粉块，取父本完全张开的花朵的花粉块置放于母本柱头蕊腔内；授粉后在母本植株挂上标签，标签上注明授粉日期、杂交父本和授粉花朵数；
[0024](2)果荚预处理与种子播种:剪取授粉205d后未开裂的成熟蒴果，用牙刷沾洗洁精仔细刷洗表皮，用手术刀剔除柱头、残留的枯瓣及表皮病虫斑，再用75%酒精擦拭;放入1%NaClO溶液浸泡15min，再用超声波清洗器震荡5?lOmin，移到超静工作台上，用消毒过的镊子取出蒴果，用无菌水清洗2次;夹取蒴果沾上75%酒精后在酒精灯上点燃消毒10s，用手指捏住果柄，使蒴果朝风口而手在后，另一手持消毒过的手术刀将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于萌发培养基表面;或将消毒过的种子移入有少量无菌水的培养瓶中摇匀，然后用无菌吸管吸取Iml摇匀悬浮液滴到萌发培养基面上，并使其分布均匀;所述萌发培养基为:1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1.0g/L+琼脂5.88/14!1为5.6。
[0025](3)种子萌发:将种子接种于萌发培养基中培养，培养温度25±2°C，光照强度1200Lux ±100,光照时间12h/d ；培养35d后开始膨胀，约60d膨大形成白色球形胚，继续培养形成白色原球茎，光下可转成绿色原球茎，培养10d后萌发的类原球茎逐渐形成白色-淡绿色的根状茎；
[0026](4)根状茎的增殖与分化:选择生长状态相近的种子萌发形成的根状茎，在无菌条件下分切成长0.6?0.8cm的切段，接种于I/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖20g/L+活性炭1.5g/L+琼脂5.8g/L的增殖与分化培养基上培养，培养温度25±2°C，光照强度1500Lux± 100，光照时间12h/d;培养70d根状茎的增殖系数达5.16，培养125d即可获得带根的健壮小苗，成苗率达90.8%。
[0027](5)壮苗生根:将根状茎分化形成的2.5?3.5cm基部饱满，叶尖开口露出心叶的幼苗小心切下，分选后剪除老根，仅留I?2条短嫩新根，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖25g/L+香蕉泥100g/L+活性炭2.5g/L+琼脂5.8g/L的生根壮苗培养基上培养，培养温度25 ± 2°C，光照强度1500Lux± 100，光照时间12h/d ；培养90d左右小苗生根率可达98.4%；
[0028](6)炼苗移栽:待瓶内的生根苗长至6.0?7.0cm、叶片3?4片、根3?4条时，将瓶苗从培养室移至温室大棚，进行炼苗，继续生长30d，炼苗温室大棚遮光率60 %，温度保持25?28°C，空气湿度保持60%?70%;出瓶种植前3?5d，打开瓶盖，让瓶内小苗适应外界的环境;取出小苗，小心洗净根部培养基，用50 %多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡3min，在阴凉处自然晾干后种植于发酵过的树皮+碎石子(质量比为2: I)的基质中，定植后用恶霉灵溶液喷灌植株及植料;2d后浇透水，以后定期进行叶面喷水和喷洒0.1 %多菌灵等杀菌剂，常规栽培管理;经过一系列的精心管理，试管苗移栽60d成活率达97.8%。
[0029]本发明具有以下优点:
[0030](I)本发明利用同一配方培养基(1/2MS+6-BA 2.0mg/L+NAA I.0mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖20g/L+活性炭1.5g/L+琼脂5.8g/L)，实现了根状茎增殖、分化同步进行，减少增殖到分化的转瓶环节，不仅提高了成苗率、降低了污染率，大大减少了工作量、节省了经济成本，还缩短了成苗时间约30d。
[0031](2)本发明在整个培养过程均添加了活性炭，其作用是吸附了培养基中的部分营养物质和代谢过程中产生的废弃物，促进种子的形态发生和器官形成。
[0032](3)本发明在移栽之前先在温室大棚中炼苗继续生长30d，有利于瓶苗假鳞茎形成、叶片增厚，为提高后期的移栽成活率奠定扎实的基础。
[0033]总之，本发明中种子萌发快，萌发率高，根状茎分化成苗时间短，能快速的获得大量试管苗;种苗质量高，成苗移栽成活率达97.8 %。为杂交兰种苗的规模化生产提供了一条有效的新途径。
[0034]本发明以杂交兰栽培种“台北小姐”为母本，以野生的西藏虎头兰为父本，开展杂交育种，解决了杂交种子无菌播种、提高种子萌发率、提高根状茎增殖与分化率、生根壮苗培养和炼苗移栽等无菌播种育苗的关键技术，获得大量杂种后代植株，不仅为选育具有新花色、花型及抗性强的优良新品种奠定物质基础，为杂交兰种苗的生产提供一条有效的新途径，促进杂交兰产业化的可持续发展，还能进一步保护野生兰花资源，本发明具有广阔的应用前景。
[0035]虽然以上描述了本发明的【具体实施方式】，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
【主权项】
1.一种杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)人工授粉:以杂交兰‘台北小姐’为母本，西藏虎头兰为父本进行杂交，取母本开花后2?4d的花朵，用消毒过的镊子去除唇瓣及柱头上的花粉块，取父本完全张开的花朵的花粉块置放于母本柱头蕊腔内；剪取授粉205d后未开裂的成熟蒴果进行无菌播种； (2)果荚预处理与种子播种: 将成熟蒴果进行预处理，然后将成熟蒴果的种子播种于萌发培养基中；所述萌发培养基为 1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭1.0g/L+琼脂5.8g/L； (3)种子萌发:将种子接种于所述萌发培养基中培养，培养温度为25±2°C，光照强度1200Lux 土 100，光照时间 12h/d ； (4)根状茎的增殖与分化培养:选择生长状态相近的种子萌发形成的根状茎，在无菌条件下分切成长0.6?0.8cm的切段，接种于I/2MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+香蕉泥80g/L+蔗糖20g/L+活性炭1.5g/L+琼脂5.8g/L的增殖与分化培养基中培养，培养温度25 ± 2°C，光照强度1500Lux± 100，光照时间12h/d; (5)壮苗生根培养:将根状茎分化形成的2.5?3.5cm的幼苗小心切下，分选后剪除老根，仅留I?2条短嫩新根，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L+鹿糖25g/L+香蕉泥10g/L+活性炭2.5g/L+琼脂5.8g/L的生根壮苗培养基中培养，培养温度25 ±2 °C，光照强度1500Lux 土 100，光照时间 12h/d ； (6)炼苗移栽:待生根苗长至6.0?7.0cm、叶片3?4片、根3?4条时，将瓶苗从培养室移至温室大棚，进行炼苗，继续生长30d，温室大棚遮光率60 %，温度保持25 ± 2°C，空气湿度保持60% ?70% ； 出瓶种植前3?5d，打开瓶盖，然后取出小苗，洗净根部培养基，用50%多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释溶液浸泡3min，阴凉处自然晾干后种植于发酵过的基质中，用恶霉灵溶液喷灌植株及植料;2d后浇透水，以后按预定周期进行叶面喷水和喷洒0.1 %多菌灵杀菌剂。2.如权利要求1所述的杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，将成熟蒴果进行预处理的具体方法如下: 将成熟蒴果置于流水下冲洗3min，用牙刷沾洗洁精仔细刷洗表皮，用手术刀剔除柱头、残留的枯瓣及表皮病虫斑，再用75%酒精擦拭;放入l%NaC10溶液浸泡15min，再用超声波清洗器震荡5?lOmin，移到超静工作台上，用消毒过的镊子取出蒴果，用无菌水清洗2次;夹取蒴果沾上75%酒精后在酒精灯上点燃消毒10s。3.如权利要求1所述的杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，将成熟蒴果的种子播种于萌发培养基中的具体操作方法如下: 用手指捏住成熟蒴果的果柄，使蒴果朝风口而手在后，另一手持消毒过的手术刀将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于萌发培养基表面;或将消毒过的种子移入有无菌水的培养瓶中摇匀，然后用无菌吸管吸取Iml摇匀悬浮液均匀滴到萌发培养基面上。4.如权利要求1所述的杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法，其特征在于:所述基质包括质量比为2: I的树皮和碎石子。
【专利摘要】本发明提供了一种杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法，以杂交兰‘台北小姐’为母本，西藏虎头兰为父本，通过人工授粉获得杂交蒴果，成熟蒴果经果荚预处理、种子播种、种子萌发、根状茎增殖与分化同步进行、壮苗生根、炼苗移栽等繁殖步骤获得杂种后代群体。本发明具有种子萌发率高，成苗数多，成苗时间短，种苗质量好等优点，移栽60d成活率达97.8％，获得的大量后代植株为杂交兰优良新品种(系)的选育奠定物质基础，同时为杂交兰种苗的生产提供一条有效的新途径。
【IPC分类】A01H1/02, A01H4/00
【公开号】CN105706900
【申请号】CN201610051245
【发明人】钟淮钦, 陈南川, 黄敏玲, 陈少云, 叶秀仙, 林榕燕
【申请人】福建省农业科学院作物研究所