一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种动物模型的构建，特别涉及一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋 亡动物模型的建立方法。 (二)
【背景技术】
[0002] 随着纳米技术的发展，纳米材料越来越多地进入到人们的生活，纳米颗粒由于其 小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，使其广泛应用于医学及化工工 业。但是，纳米颗粒有其特殊的生物活性，也使得其具有某些特殊的毒性。越来越多的研究 在关注应用纳米材料的同时，也关注纳米颗粒对人类健康和环境的潜在的影响。
[0003] 与普通锌相比，纳米氧化锌在电学、光学、国防、纺织和饲料工业等众多方面具有 更优异的性能，现已广泛应用于环保材料、陶瓷材料、纺织、饲料添加剂等许多领域。纳米氧 化锌具有强大的抗菌活性，在卫生、保健、医学等领域也得到了广泛应用例。随着产品的不 断开发和应用，人们在日常生活和工作中接触到纳米氧化锌的机会越来越多，纳米锌粒子 也因此获得了多种途径进入人体并与体内不同组织、细胞或生物分子相互作用的可能。特 别是在医学、生物学领域，纳米氧化锌产品可直接应用于人体，与血液、体液或淋巴系统接 触。与其他纳米材料相比，除了分散在空气中纳米氧化锌可经呼吸道或皮肤进入人体外，医 用产品中的纳米氧化锌更易直接进入血液循环系统，并可能分布于全身其他脏器而产生毒 副作用。纳米氧化锌之所以对细胞产生毒性，是因为纳米锌可以消弱线粒体功能，增加膜通 透性，引起细胞凋亡。
[0004] 然而，与纳米氧化锌的快速市场化形成鲜明对比的是，人们对于不同途径进入体 内的纳米氧化锌可能产生的负面生物效应或毒副作用还知之甚少，对纳米氧化锌在体内的 吸收、分布、代谢、排泄等体内行为也缺乏系统研究，这将对纳米氧化锌的进一步应用带来 潜在影响。 (三)
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法， 为研究纳米氧化锌对生物体和环境造成的影响，阐明纳米材料在体内外的特殊性质，揭示 纳米效应引起的毒性和生物活性，促进纳米锌材料在未来的生物应用中的研究提供参考， 使其更安全、广泛地贡献人类社会。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，所述方 法为:将纳米氧化锌悬浮于缓冲液中制成纳米氧化锌悬液，然后将纳米氧化锌悬液经腹腔 注射小鼠，连续注射30天，每天一次，成功构建纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型 (通常在注射结束后第3天，脱臼处死小鼠，检测小鼠血清锌含量以及肝组织SOD活力、MDA、 CAT、N0的含量;取肝组织，进行肝细胞凋亡的TUNEL法检测;利用RT-PCR对小鼠肝脏c-myc基 因和P53基因表达进行检测，筛选肝细胞凋亡的模型为本发明所述的动物模型，通常凋亡率 为60-80% );所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为50-150mg/kg。
[0008] 进一步，所述纳米氧化锌粒径为47.8 ± 5.7nm。
[0009] 进一步，所述纳米氧化锌悬液浓度为10mg/mL。
[0010]进一步，所述缓冲液为PH7.0、IOmM磷酸盐缓冲液。
[0011 ]进一步，所述小鼠为2-3月龄的ICR小鼠。
[0012]进一步，所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为125mg/kg。
[0013]所述的TUNEL法检测肝细胞凋亡步骤如下：取部分肝组织制备石蜡切片，将石蜡切 片常规脱蜡、水化，采用美国R&D公司过氧化物酶试剂盒，用荧光素标记，然后用结合了过氧 化物酶的抗荧光素抗体与荧光素结合，再与底物DAB进行显色反应，在光学显微镜下阅片， 拍照。所述的SOD的活力采用黄嘌呤氧化酶法进行测定，MDA的含量采用硫代巴比妥酸法进 行测定，CAT的含量采用可见光法进行测定，NO的含量采用硝酸还原酶法测定，血液锌的含 量用原子吸收分光光度法测定。
[0014] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:本发明建立的动物模型具有制备 简单、稳定可靠、可重复等特点，该模型对深入研究重金属中毒的发病机制的探讨以及药物 的开发提供的新的途径和思路。 (四）
【附图说明】
[0015] 图1纳米氧化锌粒径扫描电镜图。
[0016] 图2本发明所建模型的肝细胞凋亡的电镜观测图。
[0017] 图3为TUNEL法检测肝细胞凋亡图。 (五)
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0019] 实施例所采用的试剂和设备：
[0020] 1 · 10mg/mL的纳米氧化锌悬液：精密称取IOOmg纳米氧化锌加入到10mL、pH7 · 0、 IOmM的I3BS中，压力蒸汽灭菌后（121°C X15min)，4°C贮存。通过JEOL JSM-5610LV扫描电镜 扫描，保存图像，用Smile View软件打开并进行测量确定其粒径及分布。本发明所用纳米氧 化锌混悬液粒子粒径为47 · 8 ± 5 · 7nm(图1)。
[0021] 2.2-3月龄普通级ICR小鼠，由浙江省医学科学研究院实验动物中心提供。
[0022] 3.磷酸盐缓冲液(PBS)，青霉素-链霉素，L-谷胺酰胺购自购自Gibco; 0.25 %胰酶 (Typsin)购自Sigma;超氧化物歧化酶试剂盒、考马斯亮蓝蛋白试剂盒、丙二醛试剂盒购自 南京建成生物工程研究所。
[0023] 4.仪器设备：扫描电镜(JSM-5610LVJE0L);酶标仪(Genios，Tecan);倒置荧光显 微镜(DMI4000B，Leica);冷冻高速离心机(MICRO 22R);透射电镜(JEM-1230);超薄切片机 (Reichert)、轮转切片机(LeicaRM2016)。
[0024]实施例1小鼠的染毒试验
[0025] (1)将健康的2-3月龄普通级ICR小鼠随机分成5个模型组(模型组1-模型组5)和1 个生理盐水对照组，每组均为14只，雌雄各半，分笼饲养。
[0026] (2)5个模型组小鼠每天经腹腔注射剂量分别为5〇11^/1^、7511^/1^、10〇11^/1^、 125mg/kg和150mg/kg的纳米氧化锌（纳米氧化锌以10mg/mL纳米氧化锌悬液的形式加入）， 连续30天，诱导小鼠肝细胞凋亡;对照组小鼠每天经腹腔注射生理盐水，剂量为25mL/kg，连 续30天。
[0027] 实施例2不同剂量纳米氧化锌对小鼠血清锌以及肝组织SOD活力、MDA、CAT、N0的含 量的影响
[0028]用实施例1方法对小鼠腹腔注射不同剂量纳米氧化锌悬液进行染毒，注射结束后 第3天，检测小鼠血清锌含量以及肝组织SOD活力、MDA、CAT、NO的含量。
[0029] (1)肝细胞生物指标检查:检测肝组织SOD活力、MDA、CAT和NO的含量。
[0030] SOD的活力采用黄嘌呤氧化酶法进行测定，MDA的含量采用硫代巴比妥酸法进行测 定，CAT的含量采用可见光法进行测定，NO的含量采用硝酸还原酶法测定。
[0031] 结果:与对照组相比，注射剂量为125mg/kg和150mg/kg的模型组肝组织中SOD活力 显著降低(？〈0.01)，|?^含量显著提高(？〈0.01)，勵含量显著升高(？〈0.05)，041'含量降低显 著降低(？〈0.01);注射剂量为5011^/1^、751^/1^和1001^/1^的模型组肝组织中的300活力， MDA含量、NO含量和CAT含量与对照组相比没有明显的变化，提示，注射剂量为125mg/kg和 150mg/kg的模型组小鼠肝细胞发生了凋亡(表1)。
[0032] 表1不同剂量纳米氧化锌对小鼠肝细胞SOD活力、MDA、CAT、N0的含量的影响
[0034] (2)血清锌含量测定。试验结束3d后，将模型组和对照组小鼠眼眶采血，采用原子 吸收分光光度计测定小鼠血液中锌的含量(表2)。
[0035] 表2各组血液锌含量测量值比较
[0037]与对照组相比，注射剂量为125mg/kg和150mg/kg的模型组小鼠血清锌的含量明显 提高(P〈〇 · 01);注射剂量为50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg的模型组小鼠血清锌的含量与对 照组相比差异不明显(P>〇.05)。
[0038] (3)肝组织病理学检查。
[0039] 采血结束时，颈椎脱白处死各组动物。将模型和对照组的肝做解剖，立即固定于 10%的甲醛溶液中，常规包埋、切片、染色、镜检。结果显示，注射剂量为125mg/kg和150mg/ kg的模型组可见明显的凋亡小体结构（图2)。
[0040] 实施例3本发明所建模型凋亡细胞的检测
[0041 ]采用TUNEL法(TdT介导的dUTP缺口末端标记法)分析本发明实施例1所建模型的细 胞凋亡情况:取部分肝组织制备石蜡切片，将石蜡切片常规脱蜡、水化。采用美国R&D公司过 氧化物酶试剂盒，用荧光素标记，然后用结合了过氧化物酶的抗荧光素抗体与荧光素结合， 再与底物DAB进行显色反应。在光学显微镜下阅片，拍照。剂量125mg/kg和150mg/kg的模型 可见大量凋亡的肝细胞（图3)。这说明，浓度为125mg/kg及以上的纳米氧化锌悬液能明显的 引起动物的肝细胞凋亡。
[0042]实施例4肝细胞C-myc基因和p53基因表达的检测
[0043]用半定量RT-PCR方法，对实施例1不同实验组C-myc基因和p53基因在肝脏的表达 进行PCR扩增及电泳检测，用分析软件Immage Master VDS Software对电泳条带IOD (Integrated Optical Density)值进行分析并将c-myc和p53电泳条带IOD值相对于β-actin电泳条带的IOD值进行半定量分析。结果显示，剂量125mg/kg模型组和150mg/kg模型 组c-myc和p53基因表达显著上升(表3)。
[0044] 表3纳米氧化锌对肝细胞C-myc基因和p53基因表达的影响(X土SD)
[0046] 实施例5不同纳米氧化锌注射剂量对各组小鼠生长发育的影响
[0047] 将健康的2-3月龄普通级ICR小鼠随机分成5个模型组和1个生理盐水对照组，每组 均为14只，雌雄各半，分笼饲养。5个模型组小鼠每天经腹腔分别注射50mg/kg、75mg/kg、 100mg/kg、125mg/kg和150mg/kg的纳米氧化锌(纳米氧化锌以I Omg/mL纳米氧化锌悬液的形 式加入），连续30天;对照组小鼠每天经腹腔注射生理盐水，剂量为25mL/kg，连续30天。实验 结果表明：对照组以及5个模型组小鼠的死亡率分别为0、0、0、0、0和21 %，表明注射剂量为 150mg/kg时毒性过高，出现个别小鼠死亡的现象。这说明，注射剂量为125mg/kg的纳米氧化 锌悬液引起的肝细胞凋亡的病理表现是最合适的。
【主权项】
1. 一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征在于所述方法 为:将纳米氧化锌悬浮于缓冲液中制成纳米氧化锌悬液，然后将纳米氧化锌悬液经腹腔注 射小鼠，连续注射30天，每天一次，成功构建纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型； 所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为50_150mg/kg。2. 如权利要求1所述纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征 在于所述纳米氧化锌粒径为47.8 ± 5.7nm。3. 如权利要求1所述纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征 在于所述纳米氧化锌悬液浓度为10mg/mL。4. 如权利要求1所述纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征 在于所述缓冲液为PH7.0、10mM磷酸盐缓冲液。5. 如权利要求1所述纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征 在于所述小鼠为2-3月龄的ICR小鼠。6. 如权利要求1所述纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征 在于所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为125mg/kg。
【专利摘要】本发明公开了一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，所述方法为：将纳米氧化锌悬浮于缓冲液中制成纳米氧化锌悬液，然后将纳米氧化锌悬液经腹腔注射小鼠，连续注射30天，每天一次，成功构建纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型；所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为50?150mg/kg；本发明建立的动物模型具有制备简单、稳定可靠、可重复等特点，该模型对深入研究重金属中毒的发病机制的探讨以及药物的开发提供的新的途径和思路。
【IPC分类】A01K67/02
【公开号】CN105707004
【申请号】CN201610053696
【发明人】庄海峰, 林婉冰, 沈建平, 陈峥, 雷澍, 庄晓芬
【申请人】浙江省中医院