一、技术领域
本发明涉及一种青贮玉米的四倍体诱导方法，属于植物育种技术领域
二、
背景技术：
青贮玉米大多数品种营养价值高、单位面积生物学产量较高，具有气味芳香、柔软多汁、适口性好、原料中营养成分保存多、损失少等特点，是奶牛、肉牛一年四季特别是冬春季节的优良饲料。在“秸秆畜牧业”的形势下，对于满足奶牛、肉牛养殖业快速发展的饲草料需求，缓解草场压力，青贮玉米在生产和利用上具有较大的潜力，也是解决我国粮饲供需矛盾，实现粮饲有效性供给的较好途径。
自然界广泛存在植物多倍体现象，多倍体具有繁茂性、硕大性、适应力强、生物产量高等优点，一直是育种家长期追求的目标。同源多倍体育种已在葡萄(宗桦，2008)、苹果(康喜亮，2011)、水稻(符策强，2013)、扁蓿豆(王璐，2014)等多种作物中取得成功。但同源四倍体玉米应用于生产的报道还未见。四倍体玉米株型较大、叶片宽大肥厚、茎和根较粗壮、以及多果穗等特性，是极佳的青贮饲料来源。但是同源四倍体玉米诱导方法的报道较少，秋水仙素对种芽进行诱变是较为常见的方法。然而，在过去的研究中，同源四倍体玉米研究最重要的技术性难题就是染色体组多倍化的诱导频率太低，以至于同源四倍体玉米的种质资源相当有限。同源四倍体玉米的诱导频率太低的主要原因应该归咎于传统的种芽诱导技术和玉米种胚的形态结构，其原因主要包括以下两个方面：
(1)种芽的结构较为复杂，在种芽的生长点外围还包裹着胚芽鞘、不完全叶、第一片真叶、第二片真叶等多个组织，加倍溶液需要经过多个组织才能渗透到种芽的生长点并对其细胞产生染色体组多倍化的诱导作用，因此加倍溶液渗透到种芽的生长点细胞位置的难度较大。
(2)在种芽内具有不同染色体组倍性的生长点细胞的发育进度不一致，即二倍体分生细胞在生长发育上比多倍体分生细胞更有优势，以致二倍体分生细胞所产生的一大批子细胞限制了多倍体分生细胞及其子细胞的生长发育速度，最后只能由大部分二倍体分生细胞所产生的一大批子细胞完成植株的形态建成，因此当代植株的玉米果穗被诱导的几率很低。
以上两方面原因导致利用传统的种芽诱导法获得同源四倍体玉米的频率较低，因此探索一种提高四倍体青贮玉米诱导率的加倍技术，为四倍体青贮玉米研发和应用奠定基础。
三、
技术实现要素：
鉴于现有技术四倍体青贮玉米诱导频率太低的问题，本发明采用萌动期诱导和幼苗生长点诱导相结合，建立一种四倍体青贮玉米的诱导方法。该方法可以显著提高同源四倍体青贮玉米的诱导频率，以期在最短的时间内创制出更多的同源四倍体青贮玉米新种质，提高育种效率，缩短育种年限。
1.诱导方法：
(1)浸种：以二倍体玉米为试验材料，20-25℃条件下浸泡24h。4℃条件下浸泡12h，移至20-25℃条件下浸泡2-3h，重复本步骤。
(2)加倍溶液萌动期处理：倒掉清水，加入加倍溶液中，4℃的冰箱中放置12h。
(3)红外线照射：用清水冲洗种子，利用红外线灯(50hz)照射20-30s，20-25℃条件下清水浸泡24h。
(4)加倍溶液苗期处理：将种子种植在育苗盆中，正常管理，待幼苗长至3-4叶时利用注射器向幼苗茎中的生长点注射加倍溶液0.5ml，间隔12h注射一次，共注射2-3次。
(5)倍性检测及移栽：待幼苗长至五叶时，利用流式细胞仪进行倍性检测，记录检测结果，并将检测后的幼苗进行移栽。
2.有益效果
与传统技术相比，本发明涉及的四倍体青贮玉米诱导方法具有如下优势：
(1)将侵泡在清水中的种子，反复置于4℃和20-25℃，能有效提高种子活性，提高加倍效率；采用红外线照射提高细胞内酶的活性，促进种子萌发；加倍溶液中加入0.3％的二甲基亚砜可以提高细胞膜的通透性，从而提高秋水仙素的诱导效率。
(2)将加倍溶液直接注入幼苗的生长点细胞，间隔12h处理一次，处理2-3次，这有助于提高不同染色体组倍性的生长点细胞的加倍概率，提高多倍体分生细胞及其子细胞的数目，从而提高多倍体幼苗的诱导频率。
四、附图说明
图1加倍溶液注射幼苗生长点细胞
图2加倍后胚芽变化情况，表1流式细胞仪检测染色体加倍结果，表2品种间加倍率的方差分析
图3加倍后植株田间表现
五、具体实施方式
(1)浸种：将青贮玉米的种子平铺放入玻璃培养皿中，加入清水至刚刚没过种子，20-25℃的培养箱中培养24h。取出培养皿，放入4℃的冰箱中12h，移至20-25℃的培养箱中培养2-3h，重复本步骤。
(2)加倍溶液萌动期处理：将培养皿中的清水倒掉，加入加倍溶液，没过种子即可，4℃的冰箱中放置12h。
(3)红外线照射：用清水冲洗种子，利用红外线灯(50hz)每皿照射20-30s，加入清水后，在20-25℃培养24h。
(4)加倍溶液苗期处理：将种子种植在育苗盆中，正常管理，待幼苗长至3-4叶时利用1ml注射器向幼苗茎中的生长点部位注射加倍溶液0.5ml，直至溶液从叶心中渗出，间隔12h注射一次，共注射2-3次。注射方法如图1所示。
(5)倍性检测及移栽：待幼苗长至五叶时，利用流式细胞仪进行倍性检测，检测结果如表1所示，每次检测30株，三次重复，辽单527，辽单青贮178和辽原一号加倍率分别为36.3％，20.5％和21％。品种间的f统计量值为2.55，对应的p值为0.139，因此在0.05水平下认为不同品种间的加倍率差异不显著(表2)。加倍后，胚芽变得粗壮(图2)。将检测后的幼苗进行移栽，比较不同倍性间植株差异(图3)。其中加倍后的四倍体植株(a)要高于对照组(b)，同时叶面积和叶片厚度也有一定增加；而经过秋水仙素处理后未加倍成功的植株(c)与对照组无明显差异。