本发明属于生物技术领域，具体是一种驴精液冷冻保存的方法。
背景技术：
我国驴的养殖数量约有1000万头，30多个种类，主要散布在陕、豫、鲁、新、甘等地区。近年来我国驴的养殖数量持续下降，主要原因与中国大部分产业化养殖以猪、牛、羊养殖为主，驴的品种资源少、繁殖效率低有关。精液保存的目的是能最大限度地延长精子的存活时间并且维持其受精能力。保存的精液经过不同地区间的运输，可以扩大精液的使用范围，增加受配动物的数量，提高种公畜的利用效率，使优良种公畜的繁殖潜力和遗传优势能得到充分发挥。目前，马属动物精液保存的相关研究还比较少，驴的相关资料报道更少。随着养驴业的兴起和不断发展，开展驴精液保存的研究，不仅可以解决我国驴存栏量持续减少和养驴规模日益缩小的问题，也可进一步推动养驴生产的发展。精液的保存有常温保存(15-25℃)、低温保存(4℃)和冷冻保存(-196℃或-79℃)，其中只有冷冻保存可以实现精子长期保存的目的，但冷冻保存精液解冻后精子活率较低，人工授精的受胎率也较低。因而，生产中亟需开展驴精液的冷冻保存研究，建立一套适合生产中应用的驴精液冷冻保存方法和技术体系。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种驴精液冷冻保存的方法，解决规模化养驴场或基层单位利用冻精开展驴的人工授精，以提高种公驴的利用效率，加速驴群的扩繁和品种改良。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种驴精液冷冻保存的方法，该方法包括步骤如下：
(1)配置稀释液
①基础液配置：所述基础液包括按质量份数构成的下述组份：tris3.04份、柠檬酸1.70份、葡萄糖1.50份、果糖1.50份、青霉素0.06份，链霉素0.10份、双蒸水100份，将上述组份定容配置成基础液；
②稀释ⅰ液配置：按体积计取基础液85份，取新鲜卵黄液15份，充分混匀，得到稀释ⅰ液；
③稀释ⅱ液配置：按体积计取上述稀释ⅰ液80份，取0.5mg/ml氧化石墨烯20份，充分混匀，得到稀释ⅱ液；
④冷冻液配置：按体积计取上述稀释ⅱ液46份，取甘油4份，充分混匀，得到冷冻液；
(2)鲜精的处理
①以发情母驴作为台驴，假阴道法采集种公驴精液，采集的精液立即用6-8层无菌纱布过滤并收集到无菌烧杯中并封口，同时以显微镜检查精子密度和活率，精子活率大于0.70为符合标准的鲜精；
②将符合标准的鲜精和稀释ⅱ液一并放置在35℃恒温培养箱内维持1-2h，然后，吸取5ml鲜精转移至15ml无菌试管中，2500rpm离心5min，弃上清液，沿管壁缓慢加入5ml稀释ⅱ液，混合均匀得到稀释鲜精；
(3)精液的降温和平衡
将上述密封好的稀释鲜精与冷冻稀释液一并放入盛有35℃水的烧杯中，置4℃冰箱降温6-10h，然后，将已冷至4℃的冷冻稀释液吸取5ml缓慢加入降温后的精液中，混合均匀后放回4℃冰箱，平衡2小时，得到平衡后的精液；
(4)精液的冷冻及解冻
①精液冷冻，将上述平衡后的精液在4℃条件下装入0.25ml的麦管中，置-80℃超低温冰箱中20-40min，然后投入液氮冷冻保存；
②精液解冻，取冷冻后的精液放入60℃水浴中6秒进行解冻，解冻后，置37℃载物台的显微镜下(400×)观察精子的活率。
而且，所述步骤(1)的②、③及④步中按体积计取基础液、取新鲜卵黄液、取稀释ⅰ液、取0.5mg/ml氧化石墨烯、取稀释ⅱ液及取甘油均是采用20ml无菌注射器吸取。
本发明的优点和积极效果是：
本发明中的冷冻液选择了含有一定浓度的氧化石墨烯和甘油组合添加以抑制冰晶形成对精子造成的损伤，而且在精液冷冻前利用–80℃超低温冰箱对精液预先进行20-40min的冷却处理，简化了在常规精液冷冻过程中必须应用昂贵程序冷冻仪进行精液冷却处理的困难，冷冻后选择60℃的水浴对冷冻精液解冻6秒，有效提高了驴精液冷冻保存后的精子活率。
具体实施方式
以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种驴精液冷冻保存的方法，该方法包括步骤如下：
(1)配置稀释液
①基础液配置：用电子天平准确称取tris3.04g、柠檬酸1.70g、葡萄糖1.50g，果糖1.50g、青霉素0.06g，链霉素0.10g，加双蒸水100ml定容配置成基础液；
②稀释ⅰ液配置：用20ml无菌注射器分次吸取基础液共85ml至100ml灭菌容量瓶中，用去针头20ml无菌注射器吸取新鲜卵黄液缓慢加入容量瓶中，定容至100ml，充分混匀；
③稀释ⅱ液配置：用20ml无菌注射器吸取已定容至100ml容量瓶中的稀释ⅰ液20ml，丢弃此20ml稀释ⅰ液，然后用20ml无菌注射器吸取0.5mg/ml氧化石墨烯定容至100ml，充分混匀；
④冷冻液配置：用20ml无菌注射器分次吸取46ml稀释ⅱ液至50ml容量瓶中，然后用去针头的20ml无菌注射器吸取甘油定容至50ml，充分混匀；
(2)鲜精的处理
①以发情母驴作为台驴，假阴道法采集种公驴精液，采集的精液立即用八层无菌纱布过滤并收集到无菌的烧杯中并封口，快速转移至实验室用10ul微量移液器吸取精液至载玻片上，盖上盖玻片，至37℃载物台显微镜下检查精子活率，精子活率大于0.70为符合标准可以应用的鲜精；
②将符合标准的鲜精和稀释ⅱ液一并放置在35℃恒温培养箱内维持1-2h，然后，吸取5ml鲜精转移至15ml无菌试管中，2500rpm离心5min，弃上清液，沿管壁缓慢加入5ml稀释ⅱ液，混合均匀得到稀释鲜精；
(3)精液的降温和平衡
将上述稀释鲜精与冷冻稀释液一并放入盛有400ml温水(35℃)的500ml烧杯中，置4℃冰箱降温6-10h，然后，将已冷至4℃的5ml冷冻稀释液缓慢加入降温后的精液中，混合均匀后放回4℃冰箱，平衡2小时；
(4)精液的冷冻及解冻
①精液冷冻，平衡后的精液在4℃条件下装入0.25ml的麦管中，置-80℃超低温冰箱中20-40min，然后投入液氮冷冻保存；
②精液解冻，取冷冻后的精液放入60℃水浴中6秒进行解冻，解冻后，置37℃载物台的显微镜下(400×)观察精子的活率，发现精子活率可达0.40-0.50之间，与常规冷冻比较精子活率(0.25-0.40之间)有显著提升。