本发明属于作物制种、育种类，涉及一种十字花科作物化学杀雄剂组合物，并在油菜细胞质不育（cms）、双隐性两型核不育（gms）和化学杀雄（cha）制种或育种中的应用方法。
背景技术
十字花科（油菜、甘蓝、白菜、白萝卜）作物在农产品中占有重要位置，油菜的种植面积在十字花科中占90%左右，是重要的油料作物，存在着明显的杂种优势，杂种的生产主要是利用雄性不育系来完成。其杂种优势途径很多：细胞质雄性不育杂交种、细胞核雄性不育杂交种、生态型雄性不育杂交种、自交不亲和系杂交种和化学杀雄杂交种等。而细胞质不育（cms），双隐性两型核不育（gms）、三隐性核不育系和化学杀雄（cha）不育是我国油菜杂种优势利用的主要途径。
细胞质雄性不育系（cms），是我国首先在世界上实现油菜细胞质不育三系配套，我国也是最先将油菜三系杂交种（秦优2号）大面积应用于生产的国家。早在上世纪七、八十年代，我国波里玛不育系和陕2a不育系的育成，标志着油菜细胞质雄性不育系实现了三系配套，油菜杂种优势得以应用；但这类不育系的不育性很不稳定，对温度反应十分敏感，在蕾苔期如遇低温、高湿、寡照的天气，cms大量小花出现微量花粉，其育性由自交不育变成了自交可育，母本自交结实，使杂交种变为自交种，严重影响f1代种子纯度及生产安全，导致大田生产受损和杂种优势的发挥，对种子企业的损失是巨大的。从遗传角度上讲，cms的微粉危害是无法解决的“世界难题”；而通过本发明技术可彻底解决cms微粉危害。
隐性两型细胞核雄性不育系（gms），其特点是不育株雄性败育彻底，不育性很稳定，但gms中有50%的可育株，在制种生产中，必须要将50%的可育株拔除。因此gms两系制种不仅产量低、制种成本高、费工费时，制种农户和企业难以取得较好的经济效益，而且若拔除不彻底或不及时制种纯度也难以保障，大量生产gms杂交种子比较困难。
三隐性核不育系虽然成功克服了细胞质不育系和双隐性核不育系的不足，但是，三隐性核不育三系选育程序相当复杂，不易选育成功。而且我国目前选育成功的三隐性核不育系仍然存在着3个较大的缺点：三隐性核不育系熟期较晚不符合目前的育种需求；遇到不利的气候条件育性的稳定性易受到影响，可分段性的产生嵌合体，从而影响制种纯度；三隐性核不育系长势不强，而且花少，从而影响了制种产量。
化学杀雄剂诱导雄性不育（cha），是杂种优势利用的又一主要新途径，也是解决人工去雄困难的一种有效途径。它是通过化学杂交剂，诱导油菜母本雄性败育而雌蕊发育正常的一种方法，从而实现杂交育（制）种之目的；cha育(制)种方法可以直接利用常规品种配置杂交种组合，具有亲本选择自由，辅助解决微粉问题的优点，目前，已经成为杂种优势利用的重要途径。该方法不通过遗传途径获得不育群体，在作物生长发育的一定时期，通过在母本上喷施化学杀雄剂，直接杀死或抑制雄性器官，造成生理不育，以达到杀雄目的。直接获得油菜大量不育群体，从而进行配制组合，其育种方法简单、快捷、测配组合随机，亲本优良性状不会因不育（保持）系的转育而丢失，育种周期短，成本低，f1代种子使用无风险，是具有良好前景的育种方法。但由于目前缺乏理想的化学杀雄剂，cha育种尚未大面积生产应用。本发明的研制成功，使cha育种大面积成功应用于生产成为可能。
cha能否应用于生产，主要取决于化学化雄剂的效果，一个理想的化学化雄剂应具有：安全阈值宽，高效持久，环境友好，应用方便等。上世纪九十年代，国内不少单位用杀雄剂1号（甲基砷酸锌）及化杀2号（甲基砷酸钠）进行cha育种，相继选育出多个油菜杂交组合，但由于砷类化合物有致癌作用，未能推广；赤霉素(ca3)，n-c(膦酸甲基)甘氨酸，nacl，ene、xp(主要成分不详)均有一定的杀雄作用，但对施药技术要求苛刻，末能大面积应用，作为良好的化学杀雄剂较困难。
根据申请人检索，中国专利文献公开了几种解决方案：
杂交油菜制种不育系微量花粉控制方法，申请号03105011，其特征是，在油菜造胞细胞分化期～单核期，用浓度为0.15～0.3（重量）%的genesis对油菜进行喷施处理。该发明可以显著减少不育系微量花粉，在保证正常制种产量的同时，显著提高油菜杂交种纯度，制种纯度可达90～94%，而且genesis杀雄宽容度大，制种后残毒低，容易分解，有利于环境保护，同时使用方便，可提高人工施用效率，降低成本。
一种化学杂交剂组合物的使用方法，申请号：03105389，其特征在于该组合物（sx-1）含有化合物2-［3-（4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基）-3-甲基脲基磺酰基］苯甲酸甲酯、湿展剂、分散剂、增稠剂、崩解剂、可溶性淀粉等，本组合物杀雄效果彻底，对不同基因型品种杀雄效果基本一致，不育株率可达95～100%。利用sx-1可诱导油菜雄性不育，配制油菜化学杂交种。利用sx-1对cms进行辅助制种，可以减少cms的前期微粉，提高制种纯度。
一种芥菜型油菜化学杀雄剂及其制备方法和应用，申请号cn201510244257.6，该化学杀雄剂的活性成分包括：苯磺隆、乙草胺和氯吡脲；使用本发明提供的化学杀雄剂处理芥菜型油菜植株后，雄性不育诱导率高达98～100％，死花粉率达100％。并且，不产生药害
一种复配化学杂交剂组合物及其应用，申请号cn201010204238.8，本发明涉及一种复配化学杂交剂组合物及其应用。这种组合物含有化合物苯磺隆、噻吩磺隆、硼肥、分散剂、可溶性淀粉等，本组合物能够诱导十字花科作物雄性不育，雌性可育。复配化学杂交剂杀雄效果比单剂稳定彻底，雄性不育珠率95％以上，雌性可育率100％。其生物活性超过传统杂交剂100～1000倍，用量为0.15～0.3g/hm2，是一种超高效、超低用量、低毒、低残留、低成本的复配化学杂交剂。
白菜型冬油菜化学杀雄剂及其应用方法，申请专利号cn201210282252.9，本发明是一种白菜型冬油菜化学杀雄剂，其特征在于活性成分按重量百分比包括有：苯磺隆70～80%；炔草酯15～20%；甲硫氨酸5～10%。
根据专利检索，关于化杀杂交剂，一部分是组份里含有苯磺隆成分，2015年该组份在美国及欧洲一些国家已经限用或禁用。一部分是化杀不彻底，效果不好。而本发明的特点在于组份不含苯磺隆及其他可能被禁用组份，而且化杀彻底，效果好，对专利的申请和后期专利的转让更有利。。
技术实现要素：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种理想的十字花科作物化学杀雄剂组合物wp。致力于探索、优化配方，从安全、高效、广谱、低毒入手，筛选复配出二元十字花科化杀剂，并在gms“化学除杂”、cms“化控微粉”和cha“化杀育(制)种”中试验成功，并在cms制种“化控微粉”中大面积成功应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括以下步骤：
1、一种十字花科作物化学杀雄剂组合物wp的主要成分：该化学杀雄剂成品中含有苄嘧磺隆和多效唑，二者的质量比为:苄嘧磺隆：多效唑=1:100
所述苄嘧磺隆化学名称是2-{[(4.6-=甲氧基嘧啶-2-基)氨基羰基氨基]磺酰基甲基}苯甲基甲酯，化学结构是为:
所述多效唑的化学名称是(2rs，3rs)-1-(4-氯苯基)-4，4-二甲基-2-（1h-1，2，4-三唑-1-基）戊-3-醇，化学结构式是：
2、上述用于十字花科化学化雄剂组合物的配制方法步骤：
（1）称取10%苄嘧磺隆可湿性粉剂1g。
（2）称取15%的多效唑可湿性粉剂100g。
（3）将上述的苄嘧磺隆和多效唑混合均匀即得101g成品。
3、应用方法：使用时，用ph≈7的水稀释1000倍，按0.045～0.42ug/ml，用农用喷雾器，在油菜蕾苔期最大花蕾发育到1.5～3.5mm时对植株进行喷施，每株喷施药液3～6ml，即可获得理想效果。
本发明的有益效果在于：
是本发明属于一种十字花科作物育、制种化学杀雄剂组合物及应用方法。在现有农药中，具有十字花科作物杀雄作用的药剂很多，但杀雄效果良锈不一，利用不同药剂杀雄作用特点的互补性，进行试验、筛选、组配，优化配方，研制出二元复配十字花科化学杀雄剂，与现有技术相比，本发明是利用秦巴地区特有的气候条件，其不同于其它发明的突出效果特点是：
1、杀雄专一：雄蕊彻底败育，而雌蕊发育正常，自交不结实，异交正常，能获得100%的杂交种子。
2、安全阈值宽：0.045～0.42ug/ml浓度安全有效，对标耙作物极为安全。
3、应用范围广：对油菜gms、cms、cha及所有十字花科作物均有良好效果。
4、对环境友好：苄嘧磺隆和多效唑是一种常用的化学除草剂，广涉用于农业生产；苄嘧磺隆原药小鼠急性经口ld50>10985mg/kg；多效唑原药小鼠急性经口ld50>5000mg/kg，均为非重金属类化合物，在试验条件下，对动物未发现致畸、致突变、致癌作用；且应用浓度是化学除草剂的1/20，在土壤中易降解，对环境更安全。
5、使用简便、成本低廉、易于推广。自上世纪80年代开始wp化杀剂就应用于大田制种生产，为我国的油菜杂交种子生产发挥了积极作用，具有广泛的推广应用价值。
本发明的作用机制研究：
据华中农业大学刘志勇等（新型化学杀雄剂化杀灵诱导油菜雄性不育研究2006.6）等对本发明作用机理系统研究后认为：本发明内吸性强，在植物体内易于传导，有效成分活性高；油菜经本发明诱导后，促进了内源乙烯的生物合成量，增加了内源乙烯的释放量，导致雄蕊败育；处理后的油菜花药中乙烯释放量的增加，是本发明诱导油菜雄性不育表现出来的直接效果；此外，喷施本发明后吲哚乙酸（iaa）、赤霉素（ga3）、脱落酸（aba）均有显著降低，1aa的检测从0.15mgl.-1降低到0.015mg.l-1,ga3从0.500mg.l-1降低到0.080mg.l-1,aba从0.100mg.l-1降低到0.025mg.l-1。据湖南农业大学杨高礼等（新型药物对油菜的杀雄效果及机制研究2006.5）对本发明研究后认为：本发明对雄蕊作用专一，喷施本发明后药壁变薄，绒毡层解体，染色加深；花壁变薄和绒毡层解体导致花粉因发育所需营养终断而不能发育，从而形成雄蕊败育。四川农业大学唐志康等（化杀灵诱导甘蓝型油菜雄性不育研究2009.5）对本发明深入研究后得出的结论与刘志勇、杨高礼相同。
附图说明：
图1为本发明wp对油菜gms可育株“化杀除杂”效果：
细胞核不育系制种生产中必须要拔除的50%可育株的花药高于柱头，花粉丰富，自交结实正常。喷施wp化杀剂的6个花药全部缩进花托中，自交不结实。
图2为本发明wp对油菜cms“化控微粉”效果比较：
未喷施wp化杀剂的花药瘦弱，黄色、有少量微粉，自交结实。喷施wp化杀剂的花药完成退化，白色，自交不结实。
图3为本发明wp对油菜cha“化杀育种”效果比较：
自交系花瓣大小正常，雌、雄正常，花药高于柱头，花粉丰富，自交结实正常。喷施wp化杀剂的花器完成退化，6个花药已看不到，全部缩进花托中，自交不结实。a是带花瓣的照片、b是摘去花瓣的照片。
图4为本发明wp育种测配组合网室。
图5为国外育种专家来勉县考察本发明效果。
图6为国内油菜首席科学家付廷栋院士与国外专家查看本发明f1代杂交率效果。
图7为喷施本发明花粉粒醋酸洋红染色效果比较：
未喷施wp的花粉粒醋酸洋红染色后显微镜下观察，花粉粒着色很深、大小正常、形状规则；喷施wp的花粉粒小、不着色、形状不规则。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
本发明包括以下步骤：
1、一种十字花科作物化学杀雄剂组合物wp的主要成分：该化学杀雄剂成品中含有苄嘧磺隆和多效唑，二者的质量比为:苄嘧磺隆：多效唑=1:100。
2、上述用于十字花科化学化雄剂组合物的配制方法步骤：
（1）称取10%苄嘧磺隆可湿性粉剂1g；
（2）称取15%的多效唑可湿性粉剂100g；
（3）将上述的苄嘧磺隆和多效唑混合均匀即得101g成品。
3、应用方法：使用时，用ph≈7的水稀释1000倍，按0.045～0.42ug/ml，用农用喷雾器，在油菜蕾苔期最大花蕾发育到1.5～3.5mm时(此时期正值油菜的单核前期)对植株进行喷施，每株喷施药液3-6ml，即可获得理想效果。
实施例一
利用wp、氯磺隆、en、吡嘧磺隆、genesis、甲磺隆、sx-1、烟嘧磺隆赤霉素、四硼酸钠10种药剂在汉中市农业科学研究所自育的甘蓝型油菜自交系519上开展了不同化杀剂比较研究。设置了7个浓度处理：0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ug/ml。喷药次数设置1次和2次，第二次喷药时间与第一次喷药时间间隔15天。实验结果：1.wp、en、genesis、甲磺隆、sx-1五种药剂表现有杀雄效果；氯磺隆、吡嘧磺隆、烟嘧磺隆、赤霉素、四硼酸钠五种药剂都对杀雄没有反应。2、wp、en、genesis、甲磺隆、sx-1药剂各浓度处理均可诱导不育株率100％，自交结实率为0～67.6%。其中wp和en药剂0.25ug/ml与0.5ug/ml处理的不育效果表现最好，特别是进行第2次喷药的处理，表现完全自交不结实，异交正常结实，不育株农艺性状较好；其中wp药剂处理的不育株农艺性状和制种产量又优于en药剂，wp是最佳药剂。3、wp、en、genesis、甲磺隆、sx-1药剂处理浓度越大植株受到的影响越大，各药剂的高浓度处理最先开始表现停止生长，叶片平展，叶边缘稍红，卷曲，部分整叶全红，芯叶皱缩发黄，植株高度明显降低。花蕾开始变成黑色，随后逐渐出现死蕾、落蕾现象。植株长势减弱，株高低于对照，各处理的株高、主花序长度均明显降低，严重的可降2/3左右。而一次分枝数都比对照多，表现为节间缩短。生长速度减慢，生育期推迟，各处理的初花期比对照推迟1-9d。4、wp、en、genesis、甲磺隆、sx-1药剂处理对甘蓝型油菜08-519花器的大小均有影响，主要表现为：花冠直径明显变小；花瓣明显小于对照照；雄蕊花丝细弱并显著短于对照；花药干瘪色淡，明显短于对照；雌蕊花柱长度略长于对照，柱头扭曲膨大，直径较对照略大；萼片略短于对照。田间观察到各处理花蕾均有簇状，有少量死蕾落蕾。颜色有变化，有些花柱黄白色，柱头绿色，有些初开之花花瓣褪为白色、浅黄近白，或黄白相间。叶缘有少量黄斑。随着浓度的增高各处理药害很严重，死蕾落蕾多，花柄缩短，花蕾在花瓣小于萼片时裂开，花极小，有的花瓣成丝状，柱头膨大。
实施例二
利用本发明wp在油菜两型核不育系杂交种汉油6号的母本1003-2ab（gms）50%的可育株上开展了“化杀除杂”研究。汉油6号是汉中市农科所选育，通过陕西省审定。说明：“化杀除杂”保留了gms中50%的可育株，对照“人工除杂”拔除了50%的可育株。结果表明：1.利用本发明wp喷药2次（0.3ug/ml），对1003-2ab中的可育株1003-2b的平均杀雄效果可以达到96.67%。2.通过对1003-2ab喷施本发明后，单株角果数、角粒数与人工除杂后的1003-2a（ck）比较有显著增加；“化杀除杂”较“人工除杂”制种单产增加25.25%（88.48kg/70.64kg），人工费用减少50%，不仅降低了制种成本，还缓解了农村劳力短缺的矛盾。3、1003-2ab“化杀除杂”和“人工除杂”制种所得杂种纯度（98%/96%）及f1代产量（222.33kg/225.07kg）无明显差异。
“化杀除杂”是gms两系制种除杂方法的一种创新。
实施例三
利用本发明化杀剂wp在甘蓝型油菜细胞质不育系杂交种汉油8号的母本312a（cms）上连续3年开展了“化控微粉”研究。汉油8号由汉中市农科所选育，通过了国家和陕西省双审定。试验设置了6个浓度处理：0.2、0.3、0.4、0.45、0.5、0.55ug/ml，纯度鉴定在青海进行。结果表明：1.ck、0.2、0.3、0.4浓度的微粉率分别是26.5%、25.6%、26.2%和15.8%，制种纯度分别是57.95%、58.11%、59.1%和87.3%，0.2、0.3、0.4浓度制种纯度较对照分别提高0.16%、1.15%和29.35%，三个浓度效果都不理想。ck、0.45、0.5、0.55浓度的微粉率分别是32.8%、1.8%、1.6%和1.0%，制种纯度分别是48.3%、96.53%、98.41%和98.62%，0.45、0.5、0.55浓度制种纯度较对照分别提高48.23%、50.11%和50.32%，0.45、0.5、0.55浓度的制种产量分别是132kg/mu、125kg/mu、115kg/mu，三个浓度效果都理想。经连续3年试验显示，本发明复配化杀剂wp对细胞质雄性不育系312a的微粉产生具有明显的控制作用，平均制种产量可以达到124kg/mu。2.油菜cms微粉危害是通过遗传育种手段难以解决的“世界难题”，也是油菜cms制种普遍存在的一大隐患。长江流域油菜秋播三系制种在土壤肥力较高或初花期遇连阴雨或制种单产超过70kg/mu，所产的种子很难达到85%的二级纯度指标；对制种单位的损失是毁灭性的。正确的应用本发明技术能将cms微粉控制由“天控”变为“人控”；种子纯度稳定提高到93%以上、制种单产超过150kg/mu的“双高”目标是比较容易实现的。
实施例四
利用本发明化杀剂wp对化杀两系杂交种汉油1418母本zh11自交系的杀雄效果开展了研究。汉油1418是汉中市农科所选育，已经转让给四川邡牌种业有限公司。试验设置了4个浓度处理：0.075、0.1、0.25、0.5ug/ml，喷药次数2次，第二次喷药时间与第一次喷药时间间隔15天。纯度鉴定在青海进行。实验结果：1、本发明化杀剂wp对zh11有较好的杀雄效果，可诱导85～100％的全不育株率。ck、0.075、0.1、0.25和0.5ug/ml浓度处理全不育株率分别是0、85%、100%、100%、100%；制种纯度分别是50%、95%、100%、100%和100%；株高分别是167.1、166.5、156.1、146.3和120.2。0.075、0.1、0.25和0.5ug/ml浓度的制种产量分别是156kg/mu、151kg/mu、142kg/mu和105kg/mu。2、0.075ug/ml浓度对株高没有影响，但是诱导不育株率只有85%，杀雄效果没有达到制种生产上95％不育株率的要求；0.1和0.2ug/ml浓度处理可诱导100％的不育株率，且对株高没有影响或影响不大，制种产量也较高，终花时期不可育，为本发明对zh11的化学杀雄最佳施用浓度。0.5ug/ml浓度处理可诱导100％的全不育株率，但是对株高有较大的抑制作用，制种产量受到很大影响。
实施例五本发明wp推广应用状况
本发明wp是创新研制的一种油菜化学杀雄剂。本发明的成功应用有效的控制了细胞质不育系的微粉，让三系油菜杂交种种子纯度大幅提高，是细胞质不育系杂交种制种纯度的根本保障；本发明的成功应用有效的解决了两型细胞核不育系化杀制种中母本拔出50%可育株的难题，不仅大幅度提高了油菜制种产量，还降低了制种成本；本发明的成功应用实现了直接利用常规品种配置杂交种组合的突破。本发明得到了华中农业大学傅廷栋院士、湖南农业大学官春云院士的认可，并在全国推广应用，20年内，推广利用wp制种40万亩以上。本发明的应用，提高了汉中杂交油菜制种生产的技术水平，恢复了汉中油菜制种基地规模，满足了全国油菜种子20～25%供给量，使汉中成为全国杂交油菜种子生产重要基地之一，为全国油菜产业发展做出了重要贡献。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。