一种诱导产生甘蓝型油菜种子的方法及应用与流程

本发明属于甘蓝型油菜品系繁殖技术领域，具体涉及一种诱导产生甘蓝型油菜种子的方法的应用。

背景技术：

甘蓝型油菜是芸薹属十字花科油料作物，为异源四倍体，其花朵是为雌雄同花，常规繁殖方式为雌雄异交授粉产生种子，即有性繁殖。而要进行使其后代基因型与母本一致，通常采取的是愈伤组织培养、花药培养和游离小孢子培养等组织培养技术，组织培养必须建立组织培养实验室，还要投入一定的实验经费、培养掌握试验技能的人员，成本较高，且愈伤组织培养和花药培养的出产率较低；小孢子培养虽然出产率较高，但是获得的胚状体几乎全是单倍体，需要进行染色体加倍才能产生正常植株，目前染色体加倍比例还很低，导致小孢子培养效率低、成本高，只能用于实验室，难以大规模应用于油菜生产，且小孢子培养利用的是花粉，对于没有花粉的不育株，该技术就无法实施，且小孢子培养只能在无菌状态下产生胚状体，无法形成具有胚乳和种皮的种子，因而不易储藏、运输，并无法直接进行机械播种。

孤雌生殖现象在自然界广泛存在，在植物中分布更广，如茄科植物、黄瓜、兰科植物、禾本科植物、葱(洋葱和小葱)等中都存在孤雌生殖。孤雌生殖比营养体繁殖更有优势，孤雌生殖能够像有性繁殖一样产生正常的种子，生产出具有正常的种皮、胚、胚乳的种子，可以像有性繁殖产生的正常种子一样进行晾晒、储藏、运输和播种。甘蓝型油菜中也存在天然发生的孤雌生殖，但是发生率极低(0-0.364％)，难以控制，无法在油菜生产上实际利用。长久以来，油菜育种学家一直在进行油菜孤雌生殖制种的常识，如罗鹏于1981年发表论文指出可利用白菜型油菜诱导、高广东于1995年发表论文表示利用蚕豆远缘杂交诱导甘蓝型油菜孤雌生殖，但是结果表明，他们这些尝试不仅获得的远缘杂交种子很少，而且获得孤雌生殖后代中单倍体和双倍体并存，难以稳定大量地获得孤雌生殖后代，离实际应用的要求还存在差距。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种诱导甘蓝型油菜发生孤雌生殖，并大量而稳定的获得种子的诱导产生甘蓝型油菜种子的方法。

本发明的技术方案如下：

一种诱导产生甘蓝型油菜种子的方法，以甘蓝型油菜为母本，以诸葛菜为父本，蕾期人工除去母本植株雄蕊，以父本植株花粉为母本植株授粉，授粉后将母本植株花序套袋直至母本植株终花、角果膨大；成熟期收获角果得到甘蓝型油菜孤雌生殖后代种子。

进一步的，采用工授粉或自然授粉的方式为母本植株授粉。

进一步的，母本植物花序套袋的袋为硫酸纸袋，将硫酸纸袋用曲别针卡牢，每天提袋。

进一步的，所述母本为不产花粉的雄性不育系。

一种利用诱导产生甘蓝型油菜种子的方法的建立dh群体的应用。

一种利用诱导产生甘蓝型油菜种子的方法的生产雄性不育系种子的应用。

一种利用诱导产生甘蓝型油菜种子的方法加快油菜杂交育种中f1代纯合稳定速度的应用。

本发明的工作原理是，诸葛菜的花粉作为生物诱导剂，诱导甘蓝型油菜发生孤雌生殖得到可正常种植的种子。

甘蓝型油菜雌雄同花，其繁殖方式为雌雄授粉产生种子，现有技术中通过组织培养产生愈伤组织或者花粉小孢子培养产生胚状体是在现代生物技术基础上的油菜无性繁殖手段，其存在和运行的基础是需要建立现代实验室，配备相应的组织培养仪器设备，消耗大量化学试剂，还需要有掌握组织培养技术的专业技术人员，还必须遵循相应的严格操作技术规程，即使是这样，获得几乎还是单倍体胚状体，还需要进行人工染色体加倍、移栽，不能产生拥有胚乳、种皮和胚的正常种子，不能像正常种子那样方便地进行储藏、运输和机械播种；

本发明通过甘蓝型油菜与诸葛菜远缘杂交，成功地诱导产生孤雌生殖种子，植物孤雌生殖能够在植物体内自发产生具有母体遗传组成的双倍体胚、正常胚乳和种皮的种子，可以简洁、高效地实现人工种子的生产；本发明实现了甘蓝型油菜无性繁殖种子的生产，该技术在大田中就可以进行，操作简单，能保持母本植株的遗传特性不变，不需要实验室和任何现代仪器设备，也不需要专门技能的技术人员，不需要染色体加倍就能产生出便于储藏、运输和机械播种的种子，本发明在油菜的科研和生产领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的育种流程图。

图2为本发明的甘蓝型油菜(母本)苗期的图片。

图3为本发明的甘蓝型油菜(母本)花期的图片。

图4为本发明的诸葛菜(父本)花期的图片。

图5为本发明的甘蓝型油菜(母本)与诸葛菜(父本)远缘杂交结实情况。

图6为本发明的甘蓝型油菜(母本)与诸葛菜(父本)远缘杂交产生的孤雌生殖种子图片。

图7为本发明的甘蓝型油菜(母本)与诸葛菜(父本)远缘杂交产生的孤雌生殖幼苗苗期的图片。

图8为本发明的甘蓝型油菜(母本)与诸葛菜(父本)远缘杂交产生的孤雌生殖后代植株花期的图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

该方法为通过远缘杂交，诱导甘蓝型油菜稳定而大量的产生孤雌生殖种子的方法：一种诱导产生甘蓝型油菜种子的方法，以甘蓝型油菜为母本、以十字花科植物诸葛菜(又称二月兰)为父本，蕾期人工除去母本植株雄蕊，以父本植株花粉为母本植株授粉，授粉后的甘蓝型油菜花序套上硫酸纸袋，用曲别针卡牢，每天提袋，直至甘蓝型油菜终花、角果膨大，产生大量角果；成熟期收获角果，可以获得大量甘蓝型油菜孤雌生殖后代种子。在本方法中，诸葛菜花粉只起诱导作用，不参与后代种子的形成。

这些孤雌生殖后代为异源四倍体，与其母本甘蓝型油菜植株遗传组成相同，农艺性状、品质性状和抗逆性能相同，100％可育，能够正常开花结实。将这些收获的孤雌生殖产生的种子播种到田间，苗期通过流式细胞仪分析这些植株的染色体倍性，花期再考察这些单株的花粉育性，进一步验证其染色体倍性；同时在各个时期观察鉴定其农艺性状，成熟期收回其种子，通过室内种子品质分析，将结果与母本油菜比较，鉴定其为母本孤雌生殖后代；另外，我方还通过分子标记对孤雌生殖后代植株进行检测的方式进行了验证；以上验证方法均证明甘蓝型油菜(母本)与诸葛菜(父本)远缘杂交产生的种子为孤雌生殖的正常种子，本方法是切实可行且效果稳定的。

如图2-图8所示，直观的显示了本发明孤雌后代的田间农艺形状；如图5和图6所示，本发明的甘蓝型油菜(母本)经诸葛菜(父本)诱导后能够正常结实；如图2和图7所示，甘蓝型油菜(母本)苗期与孤雌生殖幼苗苗期生物形状一致；如图3、图4和图8所示，现实中图3和图8为黄色花，图4为紫色花，图3和图8中的花瓣偏圆形，花瓣间部分重叠，图4中诸葛菜的花瓣为长椭圆形，具长爪，花瓣间相互不重叠，即，孤雌生殖后代植株的农艺形状与甘蓝型油菜(母本)一致。

进一步的，采用工授粉或自然授粉的方式为母本植株授粉；人工授粉具体方式是在油菜花期，选取健壮、无病虫害的油菜植株，选取主花序或者分枝，掐掉下部小分枝、花序上的角果、已经开放的花朵和花絮顶端过小的花蕾，保留未开放、花蕾柱头未外露的花蕾，人工剥除这些保留花蕾中的花药，取当季处于花期的诸葛菜的花粉进行授粉，然后套上透明硫酸纸袋，用曲别针卡牢，以后每天人工将纸袋上提，防止伸长的幼嫩的花序被纸袋挤断，每次提袋后，再用曲别针将纸袋卡住，防止纸袋脱落或者被风刮走；直至田间内所有油菜花期结束，再将纸袋去掉，成熟期，将套袋杂交的角果分别收获、晾晒干燥、脱粒、包装和低温储藏，避免潮湿环境，防止虫鼠危害；自然授粉的方式是将诸葛菜穿插种植在甘蓝型油菜植物群体中，同样在花期去除甘蓝型油菜的花药，然后诸葛菜的花粉成熟后在风力或传粉动物的作用下授粉到母本的花蕾上；优选的，采用人工授粉的方式为甘蓝型油菜授粉。

本方法是一种全新的、能够产生种子的无性生殖方式，它将极大地降低油菜科研、育种成本、缩短育种年限，提高科研和育种效率，经济效益显著，应用前景十分广阔：

(1)可以通过本方法简便快捷地获得dh系种子，建立dh群体，以用于遗传分析。目前在油菜性状基因遗传分析中，都要建立dh群体，dh群体由单倍体加倍获得的双单倍体群体。常规的做法是，通过杂交一代f1小孢子培养，获得胚状体，在对单倍体胚状体进行染色体加倍、自交获得dh系种子，从而建立dh群体；由于不是所有胚状体都能成长为正常试管苗、试管苗移栽成活率也存在一些问题，因而单倍体胚状体加倍成功率很低，若要建立一定规模的dh群体，往往需要获得很大数量的胚状体，十分费工费时，甚至需要多年辛苦努力。而采用本发明的方法，通过诸葛菜远缘杂交授粉就可以，完全不需要实验室、实验设备、组织培养技术，仅仅通过杂交授粉就可以方便快捷地获得甘蓝型油菜dh系种子，因而可以及大地提高劳动生产力，节省人力物力；

(2)可以应用本方法生产雄性不育系种子：该方法是以不产花粉的雄性不育系作为母本，通过母体雌配子细胞而不是通常花粉小孢子培养产生胚状体，因此可以绕开花粉产生孤雌生殖种子，如对于不产生花粉的不育系，可以利用本方法产生后代种子，而且这些不育系后代种子同样是不育的，采用本发明的方法可以生产出群体中100％不育的不育系，解决目前核不育系群体多数只有50％不育系、制种过程中需要人工拔除另外50％可育株的难题，极大地节省人力物力降低核不育杂交种制种成本，降低杂交种价格，提高种子质量，促进核不育杂交种的推广普及；

(3)利用本发明的方法加快油菜杂交育种中f1代纯合稳定速度的应用：应用于油菜杂交育种，加快f1代纯合稳定速度，缩短育种年限，提高育种效率；

(4)利用本发明的方法固定杂种优势：孤雌生殖具有独特的优势，它跟营养体繁殖一样，能够保存与母体相同的基因型，因而可以用来固定杂种优势，使得杂交种不需要年年制种，大幅度降低制种成本，大幅度降低生产成本，减低杂交种的价格，便于杂种优势的大面积应用，推进油菜杂种有利的普及应用。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。