一种藜麦纯种繁育的方法与流程

本发明属于生物技术育种领域，涉及一种藜麦纯种繁育的方法，特别涉及一种利用组织培养快速繁殖单一基因型的藜麦育种技术。
背景技术：
：藜麦(chenopodiumquinoa)是一种拥有7000年历史的古老作物，原产于安第斯山脉，兴盛于印加文明，是一种耐寒耐旱的、能够适应于不能纬度和海拔的植物。其藜麦种子中的蛋白质含量高达14％，其中48％的氨基酸为人体必需氨基酸。联合国粮农组织(fao)认为藜麦是唯一一种能够满足人体基本营养需求的单体植物。被誉为人类完美的“全营养品”、人类移民太空的“理想粮食”。藜麦的人工杂交育种相对困难，而常规种每年有15％以上的异交率，1粒种子1种基因型，品种退化比较严重。利用植物组织培养技术，无性繁殖产生的植株，在遗传上才能与亲本植物完全相同，并且在无菌条件下的体培养能够在短期内获得大量脱毒植物。技术实现要素：本发明一个目的是提供一种藜麦繁殖培养基。本发明提供的藜麦繁殖培养基，包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、激动素、水解酪蛋白和麦芽糖；所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、硝酸钾、磷酸二氢钠、6-苄氨基腺嘌呤、激动素和麦芽糖；所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、α-萘乙酸和蔗糖。上述培养基中，所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、0-5mg/l的6-ba、0-5mg/l的激动素、0-2g/l的水解酪蛋白和10-40g/l的麦芽糖；所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、0-5g/l的硝酸钾、0-0.5g/l的磷酸二氢钠、0-0.5mg/l的6-ba、0-0.05mg/l的激动素和10-40g/l的麦芽糖；所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、0-5μm的α-萘乙酸和0-30g/l的蔗糖。上述培养基中，所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、1mg/l的6-ba、1mg/l的激动素、1g/l的水解酪蛋白和30g/l的麦芽糖；所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、2.7g/l的硝酸钾、0.315g/l的磷酸二氢钠、0.22mg/l的6-ba、0.018mg/l的激动素和30g/l的麦芽糖；所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、3μm的α-萘乙酸和15g/l的蔗糖。上述各个培养基还包括凝固剂。上述培养基中，所述用于组培的基本培养基为用于组培的液体基本培养基；或，所述用于组培的基本培养基为ms培养基、b5培养基或1/2ms培养基。上述的培养基在藜麦繁殖或扩繁中的应用也是本发明保护的范围。上述培养基在提高藜麦繁殖系数中的应用也是本发明保护的范围。本发明另一个目的是提供一种藜麦繁殖的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)将藜麦种子在上述诱导培养基进行诱导培养，得到丛生芽；2)将所述丛生芽在上述增殖培养基进行增殖培养，得到增殖苗；其中所述丛生芽长度为2-6cm；3)将所述增殖苗在上述生根培养基进行生根培养，得到生根苗，即实现藜麦纯种繁殖。上述方法中，所述步骤3)后还包括如下步骤：将所述生根苗进行驯化移栽，实现藜麦繁殖。上述方法中，步骤1)中，所述诱导培养为先将所述种子在所述诱导培养基中诱导培养，得到出侧芽的外植体；再将取带有单个侧芽的外植体段在所述诱导培养基中再次诱导培养，得到丛生芽；或，所述再次诱导培养的次数为1-2次；每次再次诱导培养的对象为前一次再次诱导培养长出的丛生芽。每次诱导培养前所用的丛生芽长度为2-6cm。上述方法中，步骤1)中，所述诱导培养的条件为：培养温度23-27℃，每天16h光照/8小时黑暗，培养光照强度5000-6000lx；或，步骤2)中，所述增殖培养的条件为：培养温度23-27℃，每天16h光照/8小时黑暗，培养光照强度5000-6000lx；或，步骤3)中，所述生根培养的条件为：培养温度23-27℃，每天16h光照/8小时黑暗，培养光照强度5000-6000lx。解释说明：1、本发明中出现在培养基之后的“+”(例如b5培养基+6-ba)表示该培养基(例如上述b5培养基)包含、包括或含有该“+”之后所列举的一种或多种物质(例如上述6-ba)；例如“b5培养基+6-ba”指该b5培养基包含、包括或含有6-ba。本领域技术人员应当理解的是，本发明中的“b5培养基+6-ba+蔗糖+植物凝胶”指该ms培养基包含、包括或含有6-ba、蔗糖和植物凝胶。2、在本发明中，6-ba是细胞分裂素6-卞氨基腺嘌呤的简称。3、在本发明中，naa是生长素类似物萘乙酸的简称。4、在本发明中，“0.1％的h2so4”中的0.1％是指质量体积百分比。本发明提供一种快速获得大量均一藜麦单一基因型纯种的方法。随着藜麦育种的迫切需求，一套完整、快速的、适应于工厂化生产的纯种技术成为了急需解决的技术瓶颈。该方法能够周年育苗，不受季节和气候的限制。一般20-45天为一个周期，能够提供源源不断的材料来源。种苗均为脱毒无菌苗，品质均一可控，方便于后期田间管理，适用于现代化育苗的生产线管理。与现有技术相比，本发明具有的优点如下：(1)本发明的方法实现了藜麦单一品种的快速大量繁殖，能够满足市场对藜麦纯种的大量需求，摆脱了藜麦种质资源逐年退化的限制。(2)在植物品种选择上，可适用于全部的藜麦基因型品种。(3)在藜麦种植的方法上，常规的种子播种难免会有病毒的积累，但是快繁技术可以实现脱毒苗的获得。(4)随着藜麦基因组测序的完成，这个生物胁迫和非生物胁迫极强抗性的植物，其遗传转化、基因编辑和分子育种技术已经在世界范围展开，而这些技术的基础就是快速高效的纯种繁育技术。本发明通过对藜麦进行组织培养，经过继代培养一次性获得了大量的植株幼苗，提高了藜麦的繁殖效率。(5)时间短选择无菌的藜麦种子为外植体，7天左右诱导出侧芽，14-20天诱导出第一代丛生芽，再过14-20天诱导出第二代丛生芽，再过7天增殖苗，再练苗3天，再移栽养护7天；一共培养60-80天就能够获得大量单一基因型出的苗子，扩繁时间短。附图说明图1为藜麦幼苗生长在诱导培养基上状态图。图2为藜麦幼苗生长在增殖培养基上状态图。图3为藜麦幼苗生长在生根培养基上状态图。图4为生根后的藜麦幼苗生长在大棚中状态图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中陇藜1号，记载在如下文献中：杨发荣.藜麦新品种陇藜1号的选育及应用前景.甘肃农业科技，2015年第12期.公众可从天津吉诺沃生物科技有限公司获得。下述实施例中陇藜3号,记载在如下文献中：梅丽，郭自军，王立臣，石春梅，周吉红，周继华，王俊英.15份藜麦资源在北京地区的生态适应性评价.中国农业大学学报，2019年第09期.公众可从天津吉诺沃生物科技有限公司获得。下述实施例中台湾红藜记载在如下文献中：曹宁，高旭，丁延庆，程斌，陈天青，何庆才，张立异.藜麦组织培养快速繁殖体系建立研究.种子，2018年第10期.公众可从天津吉诺沃生物科技有限公司获得。下述实施例中所用的ms基本培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如表1所示。下述实施例中所用的1/2的ms基本培养基为将表1所示的培养基中的各个溶质减半，溶于水，得到的培养基。表1为ms基本培养基配方大量元素培养基中浓度(g·l-1)nh4no31.65kno31.9kh2po40.17mgso4·7h2o0.37cacl2·2h2o0.44微量元素培养基中浓度(mg·l-1)feso4·7h2o27.8na2edta37.3mnso4·4h2o22.3znso4·4h2o8.6h3bo36.2ki0.83na2moo4·2h2o0.25cuso4·5h2o0.025cocl2·6h2o0.025有机成分培养基中浓度(mg·l-1)甘氨酸2.0盐酸硫胺素0.1盐酸吡哆素0.5烟酸vb50.5肌醇100表2为b5基本培养基配方大量元素培养基中浓度(g·l-1)(nh4)2so40.134kno32.5nah2po4·h2o0.15mgso4·7h2o0.25cacl2·2h2o0.15微量元素培养基中浓度(mg·l-1)feso4·7h2o27.8na2edta37.3mnso4·4h2o10znso4·4h2o2h3bo33ki0.75na2moo4·2h2o0.25cuso4·5h2o0.04cocl2·6h2o0.025有机成分培养基中浓度(mg·l-1)盐酸硫胺素10盐酸吡哆素1烟酸vb51肌醇100实施例1、藜麦纯种繁育所需培养基的制备1、诱导培养基诱导培养基为在ms基本培养基中添加终浓度为1mg/l的6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)、终浓度为1mg/l的kt(激动素)、终浓度为1g/l的水解酪蛋白(生工a100851)，终浓度为30g/l的麦芽糖,用koh调ph至5.8，再添加终浓度为8g/l的琼脂，121℃高压灭菌20min，制成固体培养基即为诱导培养基。2、增殖培养基增殖培养基(b5盐)为在b5基本培养基中添加终浓度为2.7g/l的硝酸钾，终浓度为0.315g/l的磷酸二氢钠，终浓度为0.22mg/l的6-ba，终浓度为0.018mg/l的kt，终浓度为30g/l的麦芽糖,用koh调ph至5.8，再添加终浓度为8g/l的琼脂，121℃高压灭菌20min，制成固体培养基即为增殖培养基。3、生根培养基生根培养基为在1/2的ms基本培养基中添加终浓度为3μm的α-萘乙酸，15g/l的蔗糖,调ph至5.8，添加终浓度为8g/l的琼脂，121℃高压灭菌20min，制成固体培养基。实施例2、藜麦纯种快速繁殖方法1、外植体消毒挑选干净健康饱满的台湾红藜的种子，先用酒精棉轻轻擦拭外植体表面的灰尘，再置于无菌玻璃瓶中，在超净工作台上用0.1％(质量体积比mg:ml)h2so4水溶液和5％(质量体积比mg:ml)naclo水溶液消毒；0.1％h2so4水溶液消毒1min，5％naclo水溶液消毒30min，无菌水冲洗4～5次，得到消毒后的种子。2、诱导出芽1)诱导出侧芽将200粒上述1消毒后的种子(每粒种子进行标记，用于后期纯种苗的溯源)接种至装有25ml实施例1制备的诱导培养基的培养皿上进行诱导培养，待7天左右共得到出侧芽的181个外植体，诱导率为90.5％；每个培养基中接入25粒种子。2)诱导出丛生芽将181个出侧芽的外植体，每个分别切成2cm的含有单个侧芽茎段，大约289个含有单个侧芽茎段，每25个含有单个侧芽茎段接种于装有25ml新鲜的诱导培养基的培养皿中进行继续诱导培养，直至长出丛生芽，记作第一代丛生芽(继续诱导培养长出丛生芽的培养时间大约14-20天)，如图1中所示。继续将每个第一代丛生芽切成2cm的丛生芽段，大约967个，每25个丛生芽段接种于装有25ml诱导培养基的培养皿中进行再次继续诱导培养，14-20天长出3182个第二代丛生芽。如此循环往复，得到第n代丛生芽。上述每次诱导培养条件如下：温度23-27℃，每天16h光照/8小时黑暗，光照强度5000～6000lx。3、增殖培养将上述2得到的3182个第二代丛生芽切成长度为2cm的丛生芽段，接种于增殖培养基(b5盐)中进行增殖培养，培养7天，得到2984株增殖苗。如图2所示。上述增殖培养基配制15瓶，每瓶50ml增殖培养基，每瓶接种8个丛生芽段。上述增殖培养的条件为培养温度23-27℃，光照时间16h/天(16h光照/8小时黑暗)，光照强度5000～6000lx。4、生根培养将步骤3得到的2984株5cm左右的增殖苗接种到生根培养基上进行生根培养7天，得到2842株10cm左右的生根幼苗。如图3所示。上述生根培养基配制5瓶，每瓶50ml生根培养基，每瓶接种12小株。上述生根培养的条件为培养温度23-27℃，光照时间12h/天(16h光照/8小时黑暗)，光照强度5000～6000lx。检测生根率，生根率＝(生根幼苗数/增殖苗数)100％结果生根率均为95.2％左右。5、驯化移栽将步骤4得到的2842株生根率达到95％以上、根长1cm以上、形态健壮的生根幼苗进行驯化炼苗(罐装在2-5cm松树皮：蛭石＝1：1的32穴盘中，加盖高度为19cm的透明盖子，暗处练苗3天)，得到2773株炼苗后的幼苗；再2773株炼苗后的幼苗取出放于平筛中，在清水下冲洗干净附着在根上的培养基，再将洗净的幼苗浸泡于0.5g/l多菌灵水溶液中10-50s，之后将幼苗移栽至移栽基质(将2-5cm消毒后的松树皮添加10g/l复合肥(奥绿肥1号)制备获得)中，再置于具有水帘风机温室中移栽养护7天，得到2643株藜麦纯种苗，如图4所示。根据种子标记溯源，2643株藜麦纯种苗分别来源于181粒台湾红藜种子；平均每个种子扩繁得到14.6株藜麦纯种苗。统计繁殖系数＝藜麦纯种苗数量/出侧芽的种子数，本发明繁殖系数＝2643/181＝14.6倍。实施例3、藜麦纯种快速繁殖方法中增殖培养基的选择增殖培养基(ms盐)：在ms基本培养基中添加终浓度为0.22mg/l的6-ba、终浓度为0.018mg/l的kt和终浓度为30g/l的麦芽糖,用koh调ph至5.8，再添加终浓度为8g/l的琼脂，121℃高压灭菌20min，制成固体培养基即为增殖培养基(ms盐)。按照实施例2的方法进行步骤1-3，得到增殖苗；其中仅将增殖培养中的增殖培养基(b5盐)替换为增殖培养基(ms盐)。计算黄化率＝(7天后增殖苗的黄化数/接种于增殖培养基的含有单个丛生芽的外植体段数)*100％结果如下表3所示：采用增殖培养基(ms盐)得到的藜麦纯种苗黄化严重，不足以苗子快速生长。表3不同基础盐的对藜麦幼苗增殖的影响实施例4、藜麦纯种快速繁殖方法的广泛适用性按照实施例2的方法，将陇藜1号和陇藜3号按实施例2的方法进行培养，得到不同品种的藜麦纯种苗。200粒陇藜1号出侧芽的种子数为179粒，且得到的藜麦纯种苗数量为3186株。200粒陇藜3号出侧芽的种子数为184粒，且得到的藜麦纯种苗数量为3956株。统计繁殖系数＝藜麦纯种苗数量/出侧芽的种子数；陇藜1号的繁殖系数＝3186/179＝17.8倍；陇藜3号的繁殖系数＝3956/184＝21.5倍。当前第1页12