一种诱导型子宫上皮特异性基因工程鼠的构建及应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导型子宫上皮特异性基因工程鼠的构建及应用。


背景技术：

2.关于子宫上皮特异性基因工程鼠的构建主要有以下几种：
3.2014年，sudhansu k.dey实验室编辑的ltf
‑
cre基因工程鼠，是一种子宫腔上皮和子宫腺体特异性表达cre酶的基因工程鼠，但是其cre酶只有在小鼠成年后才充分表达。
4.sprr2f
‑
cre(small proline
‑
rich protein 2f)也是子宫上皮敲除的基因鼠，但是特异性不好，在小脑和肾中发生泄漏表达；wnt7a
‑
cre也是宫上皮敲除的基因鼠，但同样的，在毛囊上皮中也发生了基因编辑。
5.ltf
‑
icre：成年才表达，可以通过雌激素诱导，但雌激素是雌性生殖生理病理中重要的调控激素，对实验结果影响很大。在免疫细胞中有泄漏，而免疫细胞在生殖生理中有重要的功能，影响实验结论。
6.wnt7a
‑
cre：胎儿期即表达，如目的基因在胎儿期子宫中有重要作用，可能造成子宫发育问题，无法对该基因在成年子宫的正常生理过程中的功能进行研究。
7.上述几种基因工程鼠的cre序列均为替换了相应基因的位置，造成该基因的缺失，因而只能使用杂合子(cre/+)。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于本发明的目的是构建一种可以在小鼠子宫发育和生殖过程中的任一时间点对子宫上皮细胞内基因进行敲除或报告基因表达的基因工程鼠。
9.本发明所采取的技术方案是：
10.本发明提供一种诱导型子宫上皮特异性基因工程鼠的构建方法，包含以下步骤：
11.s1：将基因型小鼠wnt7a
rtta/+
和teto
cre/+
杂交，筛选基因型wnt7a
rtta/+
teto
cre/+
的小鼠，然后将基因型为wnt7a
rtta/+
teto
cre/+
的小鼠杂交，筛选基因型为wnt7a
rtta/rtta
teto
cre/+
的小鼠；
12.s2：将基因型为wnt7a
rtta/rtta
teto
cre/+
和mtmg
f/f
的小鼠杂交，筛选wnt7a
rtta/+
teto cre/+
mtmg
f/+
小鼠。
13.在本发明的一些实施方式中，所述wnt7a
rtta/+
小鼠是通过在小鼠wnt7a基因序列下游定点敲入rtta基因表达序列构建。
14.在本发明的一些实施方式中，所述敲入的位点为：小鼠6号染色体wnt7a基因tga终止密码子下游20
‑
30bp处。在该处敲入ires
‑
rtta序列后，可以在wnt7a基因启动子的控制下同时表达wnt7a蛋白和rtta蛋白。
15.在本发明的一些优选实施方式中，所小鼠为c57小鼠。
16.在本发明的一些实施方式中，其特征在于，所述敲入的方法为crispr/cas9技术。
17.在本发明的一些实施方式中，步骤s2中所述wnt7a
rtta/rtta
teto
cre/+
为雄性小鼠，所述mtmg
f/f
为雌性小鼠。
18.在本发明的一些实施方式中，所述诱导具体为强力霉素(dox)作为诱导剂诱导，可以在小鼠子宫发育和生殖过程中的任一时间点对子宫上皮细胞内基因进行敲除或报告基因表达的基因工程鼠及其繁育、鉴定方法，做到针对不同的生理过程随时的基因或报告基因进行敲除或表达操作。
19.在本发明的一些实施方式中，所述dox的使用浓度为5mg/ml～10mg/ml。
20.在本发明的一些优选实施方式中，所述dox的使用浓度为5mg/ml或10mg/ml。
21.在本发明的一些优选实施方式中，pnd7的仔鼠子宫腔dox的注射条件为：浓度10mg/ml，体积为2～2.5μl/只，一次。
22.在本发明的一些优选实施方式中，pnd5的仔鼠腹腔dox的注射条件为：浓度10mg/ml，体积为10μl/只，一次。
23.在本发明的一些优选实施方式中，妊娠15天的母鼠自由饮水dox的条件为：浓度5mg/ml，体积6ml/只，直至小鼠出生，每天一次。
24.本发明还提供上述构建方法在制备小鼠模型中的应用。
25.在本发明的一些实施方式中，所述小鼠模型为诱导型子宫上皮特异性基因工程鼠。
26.本发明还提供上述构建方法在研究基因在子宫上皮中功能研究中的应用。
27.本发明还提供上述构建方法在小鼠子宫上皮生长和分化过程中实现对细胞谱系的追踪中的应用。
28.本发明的有益效果是：
29.本发明通过在小鼠wnt7a基因序列后面定点敲入rtta基因表达序列构建wnt7a
rtta/+
可诱导型子宫上皮特异性基因工程鼠，与teto
cre/+
小鼠以及目的基因loxp化的小鼠杂交，可以在给予dox后激活tet
‑
on系统，表达cre酶，并对目的基因进行敲除。可实现在小鼠子宫上皮细胞中时空可控的敲除或过表达感兴趣的基因，从而研究该基因在子宫上皮中的功能。该技术也可经由与报告基因小鼠杂交，从而在小鼠子宫上皮生长和分化过程中实现对细胞谱系的追踪。此外，rtta序列的插入位点为wnt7a基因序列的后面，二者通过ires相连，可以实现两个基因序列同时表达，不影响wnt7a基因本身的表达和功能，因而可以使用纯合子小鼠(rtta/rtta)，加快了目的小鼠的繁育速度。
30.而且本发明构建一种使用dox作为诱导剂，可以在小鼠子宫发育和生殖过程中的任一时间点对子宫上皮细胞内基因进行敲除或报告基因表达的基因工程鼠及其繁育、鉴定方法。做到针对不同的生理过程随时的基因或报告基因进行敲除或表达操作，通过腺体发生后腺体荧光组成最终可以推论腺体发生过程的可能机制。
附图说明
31.图1为wnt7a
rtta/+
基因鼠构建方法。
32.图2为wnt7a
rtta/+
基因鼠基因型鉴定结果。
33.图3为仔鼠pnd7子宫腔注射dox 10mg/ml，2μl，3d后子宫荧光情况。
34.图4为仔鼠pnd7子宫腔注射dox 10mg/ml，2μl，15d后子宫荧光情况。
35.图5为仔鼠pnd7子宫腔注射dox 10mg/ml，2μl，23d后子宫荧光情况。
36.图6为仔鼠pnd5腹腔注射dox 10mg/ml，10μl，5d后子宫荧光情况。
37.图7为妊娠母鼠第15天自由饮水dox 5mg/ml，6ml/天/只，仔鼠pnd5子宫荧光情况。
38.注：物镜：20
×
。
具体实施方式
39.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
40.crispr/cas9技术：crispr/cas9系统是原核生物细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制。科学家们发现，在向导rna和cas9的参与下，待编辑的细胞基因组dna将被看作病毒或外源dna，被精确剪切，这是生物学和医学领域最重要的领域之一，将增加治疗许多疾病的可能性。
41.cre
‑
loxp系统：cre重组酶可以特异性地识别长度大小为34bp的loxp碱基序列，该序列分为两端大小各为13bp的反向重复序列和中间大小为8bp间隔序列，这8bp的间隔序列也决定了loxp序列具有方向性。cre
‑
loxp系统根据loxp序列方向和位置分成以下三种基因改造方式：当两个loxp序列在同一条dna链上且方向相同时，会发生两个loxp序列中间dna片段的剪切；当两个loxp序列在同一条dna链上且方向相反时，会发生中间dna片段的颠倒；当两个loxp序列分别在两条dna链上时，会发生dna片段的交换。
42.mtmg报告基因鼠：在td
‑
tomato即表达红色荧光基因下游插入终止子，且在td
‑
tomato和终止子两端加入loxp位点，在loxp位点后面插入gfp即绿色荧光基因，在没有表达cre剪切酶时，核糖体蛋白翻译红色荧光蛋白后在终止子处停止翻译，此时，会表达红色荧光蛋白；但是当表达cre酶并剪切loxp位点后红色荧光蛋白基因序列和终止子被剪切，此时，核糖体蛋白翻译绿色荧光蛋白，即在表达cre酶的细胞中，会表达绿色荧光蛋白。r26r:rosa26reporter安全位点报告基因、td
‑
tomato:红色荧光蛋白、gfp:green fluorescent protein绿色荧光蛋白。
43.雌激素受体诱导型creer系统：将改造过的雌激素受体的配体结合区与cre酶相互融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白，使得cre
‑
loxp系统只响应外源的人工合成雌激素比如tamoxifen的刺激，给予外源药物刺激后，胞浆中的cre酶解离进入细胞核，识别loxp位点进行切割。之所以没有采用雌激素受体诱导型系统的原因是外源给予激素会严重影响子宫生理和病理状态。
44.四环素诱导型teto
‑
cre系统：四环素调控系统分为由四环素响应启动子元件控制的cre工具鼠(teto
‑
cre)和由组织特异性驱动子驱动的表达四环素转录活化因子rtta或tta的小鼠。teto本身无启动子活性，只有当具有转录活性的rtta或tta与teto结合后才能激活cre的表达，而rtta或tta与teto结合受四环素或四环素衍生物强力霉素(dox)的调节。rtta和tta分别是tet
‑
on和tet
‑
off控制元件，rtta在有dox的时候与teto结合，诱导cre表达，没有dox的时候不与teto结合，cre不表达；而tta相反，tta在没有dox的时候与teto结合，诱导cre表达，有dox的时候不能与teto结合，cre不表达，故可以通过控制给与dox的时
间与剂量，来调控报告鼠cre
‑
loxp系统的开与关。
45.实验动物:wnt7a
rtta/+
基因鼠由赛业生物公司构建，构建方法见图1，teto
cre/+
基因鼠，购于美国jackson lab，mtmg基因鼠基因由密歇根州立大学jea
‑
wook jeong教授惠赠。
46.鼠尾裂解液：tris
‑
hcl 0.24228g，kcl l0.7455 g，triton x
‑
100 200μl，加蒸馏水定容到200ml，调节溶液ph到9.0后室温保存。
47.实施例1
48.1)基因组dna提取步骤如下：
49.1.用耳标钳和配套的耳标给小鼠耳朵上打好耳标，剪取一小段约0.2cm长的尾巴组织放入1.5ml ep管中，并在ep管上写好对应的耳标号。
50.2.在每个ep管中加入200μl鼠尾裂解液和浓度为20mg/ml的蛋白酶k(invitrogen)4μl，混匀，离心使得尾巴组织淹没在混合液中，在金属加热仪中60℃3h，95℃15min，冷却后离心取上清即为小鼠基因组dna溶液。
51.2)琼脂糖凝胶电泳：
52.2％琼脂糖凝胶配制：于锥形瓶中加入120ml 1
×
tea工作液和2.4g琼脂粉，放入微波炉中加热至琼脂糖全部溶解，按照1比2000加入6μl的核酸染料(生工生物工程)，摇匀后尽快倒入已经组装好的制胶器中，放在水平位置放置大概30min左右冷却凝固。
53.取10μl样品溶液进行点样，使用东盛生物公司的100bp ladder(条带大小依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp)标记条带大小。120v电泳30min，使用凝胶成像仪成像。
54.3)小鼠基因型鉴定方法：
55.wnt7a
rtta/+
基因鼠基因型鉴定中所用到的引物为：
56.wnt7a
‑
wt
‑
f3：gtgcgtgccagtcgaaacaa(seq id no.1)；
57.wnt7a
‑
wt
‑
r3：ttgctatgacgaggcccgag(seq id no.2)；
58.wnt7a
‑
rtta
‑
f2：gttgtgagttggatagttgtggaa(seq id no.3)；
59.wnt7a
‑
rtta
‑
r4：gagtaattccagagcgccgtt(seq id no.4)。
60.pcr程序：94℃30min；94℃30s，60℃35s，72℃，35s，35个循环；72℃，5min；4℃保存。
61.其中f3r3 wt：624bp，f2r4 rtat：277bp。鉴定结果见图2。其中条带1为阴性对照组，条带2为wt(野生型)，条带3为rtta/+，条带4为rtta/rtta，条带5为marker。
62.可以看出基因型鉴定方法可以准确无误的分辨出小鼠基因型。
63.实施例2
64.wnt7a
rtta/+
teto
+/+
mtmg
f/+
的构建方法主要分为两步：
65.s1：先将基因型小鼠wnt7a
rtta/+
和teto
cre/+
杂交，第一代得到基因型是wnt7a
rtta/+
teto
cre/+
的概率为1/4，接着将基因型均为wnt7a
rtta/+
teto
cre/+
的一对雌雄性小鼠杂交，得到基因型为wnt7a
rtta/rtta
teto
cre/+
的概率为1/8。
66.s2：将基因型分别为mtmg
f/f
和wnt7a
rtta/rtta
teto
cre/+
的一对雌雄性小鼠杂交,后代中基因型是wnt7a
rtta/+
teto
cre/+
mtmg
f/+
的小鼠可以用于dox诱导型实验，而基因型是wnt7a
rtta/+
teto
+/+
mtmg
f/+
的小鼠可作为对照小鼠。
67.实施例3
68.在新生鼠出生后第7天，进行子宫腔注射手术，在新生仔鼠子宫腔中给予dox 2μl，浓度为10mg/ml。其中仔鼠子宫腔注射手术是技术关键点，因为仔鼠子宫腔太小，而且仔鼠身体虚弱，还处于哺乳阶段，手术方法和术后仔鼠恢复过程都需要仔细反复试验以确定最佳方案。经过反复摸索和实践，得出以下经验：
69.第一，在对麻药的选取上，选择了毒性较小而且操作方便的乙醚，手术经验得出pnd7的仔鼠大约用乙醚麻醉1min后便可以开始手术，手术过程一共控制在7min左右。
70.第二，术前将母鼠与雌性仔鼠单独分出一笼，可以更好的保证仔鼠的营养，并避免笼中其他成年鼠对术后仔鼠的伤害。侧部子宫位置的上方开口，撕离腹膜，找到子宫，一只手拿镊子轻轻固定子宫，另一只手拿胰岛素针先在子宫上扎开一个小口，然后将毛细吸管中的dox药物注入子宫中。然后将子宫复位，缝合皮肤后擦干伤口处的血迹并涂抹一层液体创口贴，一方面可以减少术部皮肤污染，加快术部皮肤愈合，另一方面可以隔绝伤口处的血腥味，因为血腥味容易引起母鼠食仔的情况发生。通过一系列的摸索和练习，正常情况下，仔鼠子宫腔注射手术的成功率可以达到70％以上。
71.手术采用粗细在1.8mm～2.2mm的毛细吸管在酒精灯火焰上上拉细后连接长软管作为注射器，手术操作全部在体视镜下进行。注射量大概在2μl左右，在仔鼠腹在出生后第10天、第18天、第30天取材，通过不同时间点取材可以看到：
72.在出生后第7天给予dox，出生后第10天小鼠子宫腔上皮部分被标记表达绿色荧光，接下来将在不同的手术后天数取材小鼠子宫并观察小鼠子宫荧光情况，主要观察出生后第7天给予dox，出生后第10～30天小鼠子宫腺体荧光组成情况；其中仔鼠pnd7子宫腔注射dox 10mg/ml 2μl，3d后子宫荧光情况如图3所示，仔鼠pnd7子宫腔注射dox 10mg/ml2.5μl，15d后子宫荧光情况如图4所示，仔鼠pnd7子宫腔注射dox 10mg/ml 2.5μl，23d后子宫荧光情况如图5所示。说明在wnt7a
rtta/+
teto
cre/+
mtmg
f/+
鼠中，可以在早期诱导目的基因的敲除和表达。
73.实施例4
74.在新生鼠出生后第5天，腹腔注射dox，浓度为10mg/ml，剂量为10μl，五天后取材子宫，子宫荧光情况如图6所示。说明在wnt7a
rtta/+
teto
cre/+
mtmg
f/+
鼠中，可以在早期诱导目的基因的敲除和表达。
75.实施例5
76.在基因型为mtmg
f/f
和wnt7a
rtta/rtta
teto
cre/+
的一对雌雄性小鼠繁殖笼中，在mtmg
f/f
雌性小鼠见栓第15天上午在饮水中添加dox浓度为5mg/ml，蔗糖浓度为1g/ml。妊娠母鼠的饮水量约为6ml/天/只，保证饮水充足，一直到仔鼠出生后第五天恢复正常饮水。仔鼠pnd5取材子宫，子宫荧光情况如图7所示。说明在wnt7a
rtta/+
teto
cre/+
mtmg
f/+
鼠中，可以在早期诱导目的基因的敲除和表达。
77.上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。