一种细胞冻存液及实施方法与流程

1.本发明涉及细胞冻存技术领域，具体为一种细胞冻存液及实施方法。


背景技术：

2.细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用，目前，细胞冻存主要的技术为液氮冷冻法，实际冻存过程中，需要进行梯度温度冻存，并加入适量的保护剂以保证细胞内外的水分不会形成冰晶造成细胞的损伤或死亡。常用的低温保护剂如dmso，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点，提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时，促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀，稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。
3.但现有的冷冻保护剂存在以下缺陷：dmso存在严重的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性，不能够用于临床上冷冻保护菌液给病人使用；胎牛血清也是目前细胞冻存最常用的胞外保护剂之一，但动物血清存在感染病原体与导致免疫排斥反应、差异性和不稳定性等问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种细胞冻存液及实施方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种细胞冻存液，配方包括：生理盐水、甘油、葡萄糖和海藻糖，各组分的质量百分比含量分别是：85％的生理盐水、10％的甘油、3％的葡萄糖和2％的海藻糖。
6.一种细胞冻存液的实施方法，包括步骤一，原料称取；步骤二，制备冻存液；步骤三，灭菌处理；步骤四，细胞冻存；
7.其中上述步骤一中，以各组分的质量百分含量之和为1计，称取85％的生理盐水、10％的甘油、3％的葡萄糖和2％的海藻糖，备用；
8.其中上述步骤二中，将步骤一中所称取的生理盐水加入到烧杯中，并依次加入甘油、葡萄糖和海藻糖，搅拌混合后，得到冻存液；
9.其中上述步骤三中，取步骤二中所制备的冻存液，灭菌处理后备用；
10.其中上述步骤四中，对待冻存的细胞进行预处理，向其中添加适量的冻存液，调整细胞密度后分装入冻存管中，每管1-1.5ml，梯度降温至-70℃，并保温放置12-24h，最后移入液氮容器内保存即可。
11.优选的，所述步骤二中，采用磁力搅拌机进行搅拌，搅拌时间为30min。
12.优选的，所述步骤三中，采用紫外线进行灭菌处理，紫外线灯照射时间为10-20min。
13.优选的，所述步骤四中，细胞预处理具体为：首先去除旧培养液，并使用pbs清洗细
胞；然后去除pbs，加入适量胰蛋白酶消化单层生长的细胞，离心处理后，去除胰蛋白酶，备用。
14.优选的，所述步骤四中，调整细胞密度为5
×
10
6-5
×
107个/ml。
15.优选的，所述步骤四中，梯度降温的降温速率为5-10℃/min。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所制备的冻存液通过采用甘油与海藻糖降低冰点保护细胞，通过生理盐水减少甘油的高渗作用，通过葡萄糖为细胞提供营养，该冻存液对细胞无不良影响，能有效保证细胞活性，提高细胞复活的成活率。
附图说明
17.图1为本发明的方法流程图。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.请参阅图1，本发明提供的一种技术方案：
20.实施例：
21.一种细胞冻存液，配方包括：生理盐水、甘油、葡萄糖和海藻糖，各组分的质量百分比含量分别是：85％的生理盐水、10％的甘油、3％的葡萄糖和2％的海藻糖。
22.一种细胞冻存液的实施方法，包括步骤一，原料称取；步骤二，制备冻存液；步骤三，灭菌处理；步骤四，细胞冻存；
23.其中上述步骤一中，以各组分的质量百分含量之和为1计，称取85％的生理盐水、10％的甘油、3％的葡萄糖和2％的海藻糖，备用；
24.其中上述步骤二中，将步骤一中所称取的生理盐水加入到烧杯中，并依次加入甘油、葡萄糖和海藻糖，采用磁力搅拌机搅拌30min，得到冻存液；
25.其中上述步骤三中，取步骤二中所制备的冻存液，采用紫外线灯照射20min后备用；
26.其中上述步骤四中，取待冻存的细胞，首先去除旧培养液，并使用pbs清洗细胞；然后去除pbs，加入适量胰蛋白酶消化单层生长的细胞，离心处理后，去除胰蛋白酶，再向其中添加适量的冻存液，调整细胞密度为5
×
10
6-5
×
107个/ml，然后分装入冻存管中，每管1-1.5ml，以5-10℃/min的降温速率梯度降温至-70℃，并保温放置12-24h，最后移入液氮容器内保存即可。对比例1：
27.一种细胞冻存液，配方包括：生理盐水、甘油和葡萄糖，各组分的质量百分比含量分别是：87％的生理盐水、10％的甘油和3％的葡萄糖；实施方法与实施例相同。
28.对比例2：
29.一种细胞冻存液，配方包括：生理盐水、甘油和海藻糖，各组分的质量百分比含量分别是：88％的生理盐水、10％的甘油和2％的海藻糖；实施方法与实施例相同。
30.对比例3：
31.一种细胞冻存液，配方包括：生理盐水、葡萄糖和海藻糖，各组分的质量百分比含量分别是：95％的生理盐水、3％的葡萄糖和2％的海藻糖；实施方法与实施例相同。
32.取上述实施例和对比例中所制备的冻存液冻存内口腔细胞，并在冻存14天后取出复苏，计算细胞活率，结果如下表：
[0033] 实施例对比例1对比例2对比例3生理盐水/％85878895甘油/％1010100葡萄糖/％3303海藻糖/％2022细胞活率/％94.857.371.62.6
[0034]
基于上述，本发明所采用的海藻糖能与细胞膜发生相互作用，在冻存和复苏过程中稳定膜蛋白结构，能形成玻璃态基质减少细胞外部形成的冰晶对细胞造成的伤害，生理盐水可适当降低甘油的高渗作用，葡萄糖可适当增加冻存液的营养成分，甘油则可很好地起到降低凝固点的作用，该冻存液没有加入dmso与动物血清，规避了绝大多数的风险，且做到集四种成分优点于一身，能够有效达到保护细胞活性与数量的作用，能够提高细胞复活的成活率。
[0035]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。


技术特征：
1.一种细胞冻存液，配方包括：生理盐水、甘油、葡萄糖和海藻糖，其特征在于：各组分的质量百分比含量分别是：85％的生理盐水、10％的甘油、3％的葡萄糖和2％的海藻糖。2.一种细胞冻存液的实施方法，包括步骤一，原料称取；步骤二，制备冻存液；步骤三，灭菌处理；步骤四，细胞冻存；其特征在于：其中上述步骤一中，以各组分的质量百分含量之和为1计，称取85％的生理盐水、10％的甘油、3％的葡萄糖和2％的海藻糖，备用；其中上述步骤二中，将步骤一中所称取的生理盐水加入到烧杯中，并依次加入甘油、葡萄糖和海藻糖，搅拌混合后，得到冻存液；其中上述步骤三中，取步骤二中所制备的冻存液，灭菌处理后备用；其中上述步骤四中，对待冻存的细胞进行预处理，向其中添加适量的冻存液，调整细胞密度后分装入冻存管中，每管1-1.5ml，梯度降温至-70℃，并保温放置12-24h，最后移入液氮容器内保存即可。3.根据权利要求2所述的一种细胞冻存液的实施方法，其特征在于：所述步骤二中，采用磁力搅拌机进行搅拌，搅拌时间为30min。4.根据权利要求2所述的一种细胞冻存液的实施方法，其特征在于：所述步骤三中，采用紫外线进行灭菌处理，紫外线灯照射时间为10-20min。5.根据权利要求2所述的一种细胞冻存液的实施方法，其特征在于：所述步骤四中，细胞预处理具体为：首先去除旧培养液，并使用pbs清洗细胞；然后去除pbs，加入适量胰蛋白酶消化单层生长的细胞，离心处理后，去除胰蛋白酶，备用。6.根据权利要求2所述的一种细胞冻存液的实施方法，其特征在于：所述步骤四中，调整细胞密度为5
×
10
6-5
×
107个/ml。7.根据权利要求2所述的一种细胞冻存液的实施方法，其特征在于：所述步骤四中，梯度降温的降温速率为5-10℃/min。

技术总结
本发明公开了一种细胞冻存液及实施方法，配方包括：生理盐水、甘油、葡萄糖和海藻糖，实施方法包括：步骤一，原料称取；步骤二，制备冻存液；步骤三，灭菌处理；步骤四，细胞冻存；所述步骤三中，采用紫外线进行灭菌处理，紫外线灯照射时间为10-20min；所述步骤四中，细胞预处理具体为：首先去除旧培养液，并使用PBS清洗细胞；然后去除PBS，加入适量胰蛋白酶消化单层生长的细胞，离心处理后，去除胰蛋白酶，备用；本发明所制备的冻存液通过采用甘油与海藻糖降低冰点保护细胞，通过生理盐水减少甘油的高渗作用，通过葡萄糖为细胞提供营养，该冻存液对细胞无不良影响，能有效保证细胞活性，提高细胞复活的成活率。胞复活的成活率。胞复活的成活率。


技术研发人员：余鸿楷 刘鸿基 曾筱恬 黄淑宇 符维萂 游慧 何香荔
受保护的技术使用者：广州星望医疗科技有限公司
技术研发日：2022.07.11
技术公布日：2022/9/15