一种小鼠条件性诱导Hmox1基因敲除模型的构建方法及应用

本发明涉及一种小鼠条件性诱导hmox1基因敲除模型的构建方法及应用，属于生物。

背景技术：

1、基因敲除是一种重要的遗传工程技术。它通过同源重组的方法在染色体上用外源的已突变基因替换内源的正常同源基因，从而使内源基因失活。研究者通过观察特异内源基因失活后动物的表型，来推断特异基因的功能。

2、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,ho-1)是血红素分解代谢过程中的限速酶之一，参与血红素分解代谢和多种生理功能。ho-1的生物学特性主要归因于其酶活性，它分解代谢血红素后产生胆绿素、co和fe2+，同时它的合成主要在转录水平上受到调节。因此ho-1在多种生物学过程中发挥抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。近年来，ho-1在肺部相关疾病中颇受关注。ho-1能够减轻各种有害因素导致的肺泡ii型上皮细胞损伤，促进细胞增殖和转分化为肺泡i型上皮细胞，在肺组织的损伤修复过程中发挥关键作用。ho-1sirna能够增强木屑烟萃取物对原代培养肺泡ii型上皮细胞的促凋亡作用并抑制其增生。但ho-1在肺泡ii型上皮细胞中的作用机制尚不清楚。hmox1全身性基因敲除小鼠会导致胚胎致死，因此为了更清楚研究其功能，构建hmox1肺泡ii型上皮细胞条件性基因敲除小鼠模型尤为必要。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种hmox1诱导性条件性基因敲除小鼠模型，能够克服现有技术中hmox1全身基因敲除小鼠胚胎致死的难题，辅助hmox1在肺部疾病中的功能和机制研究。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种hmox1诱导性条件性基因敲除小鼠模型，该模型由以下步骤构建：设计floxp位置；cas9/grna靶点设计；grna的活性检测；同源重组模板(donor质粒)的构建；hmox1-floxp小鼠的构建；hmox1-floxp小鼠与组织特异性表达cre的小鼠杂交获得稳定遗传子代；小鼠急性肺损伤模型中检测肺损伤情况。

3、本发明采用crispr/cas9系统制备hmox1肺泡ii型上皮细胞特异的诱导性基因敲除小鼠动物模型。本申请通过设计针对hmox1基因的grna引导cas9核酸酶对插入位置的基因组进行修饰，从而造成该基因修饰区域同源重组效率增加，将目的片段同源重组到目的位点。具体地，将cas9 mrna、grna和同源重组载体混匀后，注射入小鼠的受精卵中，则cas9蛋白在grna的靶向作用下对hmox1基因的dna双链进行切割，从而诱发同源重组修复机制以同源重组载体为模板对损伤的hmox1基因进行修复，将loxp序列整合到小鼠基因组中的特定位点。

4、本发明的第一个目的是提供一种hmox1诱导性基因敲除小鼠动物模型的构建方法，所述方法为：

5、(1)针对floxp位点设计cas9/grna和donor dna质粒；

6、(2)将donor dna质粒以及cas9/grna注射至野生型小鼠的受精卵中，并将受精卵移植至野生型小鼠，该小鼠产下仔鼠即f0代小鼠；

7、(3)将f0代小鼠与野生型小鼠杂交，获得f1代杂合子；

8、(4)将f1代杂合子互配，繁育得到f2代小鼠，即为hmox1-floxp小鼠；

9、(5)将hmox1-floxp小鼠与组织特异性表达cre的小鼠杂交获得稳定遗传子代。

10、在一种实施方式中，步骤(1)中，在第二个外显子的两边定点插入floxp位点。

11、在一种实施方式中，所述第二外显子的氨基酸序列如seq id no.28所示，核苷酸序列如seq id no.27所示。

12、在一种实施方式中，步骤(1)中，grna的序列为不包含pam序列的seq id no.13或seq id no.24所示。

13、在一种实施方式中，步骤(2)中，利用显微注射技术将donor dna质粒以及cas9/grna植入野生型小鼠的受精卵中。

14、在一种实施方式中，步骤(2)和(3)中，野生型小鼠的品系为c57bl/6。

15、本发明第二个目的是提供根据上述方法构建得到的小鼠在研究与hmox1基因缺陷相关疾病中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。

16、本发明的第三个目的是提供根据上述方法构建得到的小鼠在筛选用于治疗或预防hmox1基因相关疾病的药物中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。

17、本发明的第四个目的是提供根据上述方法构建得到的小鼠在研究hmox1基因相关功能与作用机理中的应用。

18、在一种实施方式中，所述应用为研究hmox1基因与海水淹溺性肺损伤的相关机理。

19、本发明的有益效果：

20、1.hmox1肺泡ii型上皮细胞特异的诱导性基因敲除小鼠为研究肺部疾病的发病机理和治疗提供动物模型。

21、2.不会出现基因敲除导致小鼠致死无法构建模型的现象。

22、3.在小鼠急性肺损伤模型中证明肺泡ii型上皮细胞中hmox1基因诱导性条件性基因敲除后会加重肺损伤、炎症和氧化应激情况。

技术特征：

1.一种构建hmox1诱导性基因敲除小鼠动物模型的方法，其特征在于，所述方法为：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在第二个外显子的两边定点插入floxp位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二外显子的氨基酸序列如seqidno.28所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，grna的序列如seq id no.25或seq id no.26所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，利用显微注射技术将donordna质粒以及cas9/grna植入野生型小鼠的受精卵中。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，野生型小鼠的品系为c57bl/6。

7.根据权利要求1～6任一所述方法构建得到的小鼠在研究与hmox1基因缺陷相关疾病中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。

8.根据权利要求1～6任一所述方法构建得到的小鼠在筛选用于治疗或预防hmox1基因相关疾病的药物中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。

9.根据权利要求1～6任一所述方法构建得到的小鼠在研究hmox1基因相关功能与作用机理中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为研究hmox1基因与海水淹溺性肺损伤的相关机理。

技术总结
本发明公开了一种小鼠条件性诱导Hmox1基因敲除模型的构建方法及应用，属于生物技术领域。本发明提供的小鼠条件性诱导Hmox1基因敲除模型由以下步骤构建：构建同源重组DNA载体；通过体外转录获得Cas9mRNA和针对Hmox1基因的gRNA；将同源重组DNA载体、Cas9mRNA和gRNA注射到小鼠的受精卵中；培育获得条件性基因敲除小鼠；通过测序和核酸胶电泳鉴定基因型；得到的条件性敲除小鼠与其他组织特异性表达Cre的小鼠杂交获得相应组织或细胞条件性敲除小鼠，从而实现特定组织或细胞类型的精准研究；并且证明Hmox1诱导性条件性敲除明显加重急性肺损伤。本发明能够克服现有技术中Hmox1全身基因敲除小鼠胚胎致死，无法构建小鼠模型的困难，辅助Hmox1在疾病中的研究。

技术研发人员：庞庆丰,吴亚先,高智琦,陈丹,张艳丽,李胜朋,满凌云
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11