可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法与流程

本发明涉及基因编辑，特别涉及一种可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法。

背景技术：

1、犬的生理机理特征与人类相近，例如在血液系统等全身系统疾病的治疗研究上与人类更相似，目前犬逐渐成为人类疾病模型模拟、药物临床前测试等临床相关应用的首选模型动物。同时，犬基因组与人类高度相似，其自发360多种遗传疾病致病机理与临床表现与人类相似，用其制备的人类遗传疾病beagle犬模型可提高临床预测准确性，在aav系统用药、基因编辑系统性给药等基因治疗等方面能为临床应用提供更具体的参考，同时犬寿命较长，也适合用于治疗后长时间的观察，探讨基因编辑工具在体内应用的长期有效性、安全性。

2、目前常用的疾病模型犬制备方法主要是对健康犬只进行药物诱导、手术等方法，但通过这些方法制备疾病模型犬存在表型持续时间短、无法精准模拟人类疾病病理表现、无法遗传下一代等问题。而通过基因编辑的方法对犬基因组进行修饰，其病理表现为疾病原发症状，表现持续时间长，且可通过生殖系传递到下一代。

3、血友病(hemophilia)是一种凝血功能障碍引起的遗传性疾病。人体中的凝血过程受多种主要由肝脏分泌的凝血因子调控，在凝血因子(凝血因子iii、iv、vii、ix、x等)的层级激活后将凝血酶原(凝血因子ii)转化为凝血酶，进一步激活纤维蛋白原(凝血因子i)成熟为纤维蛋白，纤维蛋白在激活的凝血因子viii催化下形成网状的纤维状蛋白多聚体，将红细胞固定在纤维网内，产生凝血块完成凝血过程。血友病患者可出现自发性出血、凝血时间延长、轻微创伤即有明显出血倾向等病征，患者常见关节出血导致关节畸形或器官内出血，严重者可能出现颅内出血危害生命。血友病可分为甲型、乙型和丙型三种类型，他们分别由于因子viii、因子ix和因子xi功能异常或缺乏所致。从凝血因子水平可分为重型(占25％，凝血因子ⅷ少于正常水平1％)、中型(占15％，凝血因子ⅷ正常水平1-5％)和轻型(占60％，凝血因子ⅷ正常水平6-30％)血友病三种类型。轻型血友病一般仅在严重创伤时表现出凝血功能异常，正常生活较难被发现。中型和重型血友病自发性出血倾向严重，其主要治疗方案通常采取输注凝血因子ⅷ(包括正常人血液分离的、或人工生产的重组因子viii，如：alphanate、hemofil-m、monarc-m等)。但外源性凝血因子ⅷ在体内存在半衰期，该疗法患者需长期定期接受治疗，对患者经济和精神带来沉重压力，严重影响患者的生活质量。特别地，由于外源凝血因子ⅷ的氨基酸序列差异，在接受外源注射的10％-20％病人中有机会产生抗凝血因子ⅷ抗体，导致治疗效果下降甚至无效。另外的疗法如肝移植等可免去长期用药的麻烦，但由于需临床上严格的配型和器官来源短缺，只有少部分患者能进行肝移植手术治愈。

4、近年来，aav介导的crispr/cas9基因编辑工具及ips分化的凝血因子viii过表达内皮细胞移植到小鼠中等基因治疗、细胞治疗方法成功运用与甲型血友病小鼠模型的治疗中，结果表明改善甲型血友病小鼠模型的凝血功能，但小鼠寿命较短，无法对基因治疗、细胞治疗效果进行长期有效性、安全性评估。犬是药物临床前实验最常用的实验动物，是是理想的模型动物，因而制备可遗传甲型血友病疾病模型犬，将为血友病基因治疗、细胞治疗及其治疗效果长期有效性、安全性提供动物模型，为人类甲型血友病临床前治疗治疗提供宝贵的实验数据，因此制备可遗传甲型血友病模型犬意义重大。

5、有鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

1、本申请的目的提供了一种可遗传甲型血友病模型犬的建立方法，采用该方法建立的甲型血友病模型犬表型显著，且可以通过稳定遗传。

2、在本申请的第一方面，提供一种可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，所述建立方法包括如下步骤：

3、利用基因编辑技术对犬受精卵的fviii基因的外显子进行点突变，然后将所得fviii基因外显子点突变的犬受精卵移植到受体母犬进行发育，从出生幼犬中筛选出甲型血友病犬作为甲型血友病模型犬。

4、在其中一些实施方式中，所述外显子包括第14外显子。

5、在其中一些实施方式中，所述第14外显子包含seq id no:1所示的片段且所述片段的第6位核苷酸由a突变为g。

6、在其中一些实施方式中，所述甲型血友病模型犬的基因组包含seq id no:3或者seq idno:4所示的片段。

7、在其中一些实施方式中，点突变的方法包括abemax、crispr/cas9、talen或者zfn。

8、在其中一些实施方式中，对犬的受精卵的fviii基因的外显子进行点突变，包括如下步骤：

9、针对所述第14外显子的序列确定打靶位点片段，设计扩增引物对，通过pcr扩增，制备sgrna体外转录模板；

10、分别体外转录所述sgrna体外转录模板和abemax，制备所述sgrna的rna及abemax的mrna，并将所述rna的rna和所述abemax的mrna混合后显微注射到受精卵的胞质中。

11、在其中一些实施方式中，所述建立方法满足如下条件中的一个或者多个：

12、(1)所述打靶位点片段如seq id no:1所示，

13、(2所述扩增引物对如seq id no:8和seq id no:9所示；

14、(3)所述rna的注射浓度为45ng/μl-55ng/μl；和，

15、(4)所述mrna的注射浓度为150ng/μl-250ng/μl。

16、在其中一些实施方式中，所述犬受精卵来自比格犬或/和所述受体母犬为比格犬。

17、在本申请的第二方面，提供第一方面所述建立方法建立的甲型血友病模型犬的细胞、组织或者器官。

18、在本申请第三方面，提供检测第一方面所述建立方法建立的甲型血友病模型犬、第二方面提供的所述的细胞、组织或者器官的检测引物对或者包括所述检测引物的试剂盒；所述检测引物对如seq id no:5和seq id no:6所示。

19、相对于传统技术，本申请的有益效果包括：

20、本申请通过对犬受精卵的fviii基因的外显子进行点突变，然后胚胎移植到受体(包括犬)进行发育，从而构建得到甲型血友病模型犬。采用该方法构建的甲型血友病模型犬是世界上第一例基因编辑甲型血友病模型犬，遗传性能稳定，能够可用于人类甲型血友病治疗新技术的研究，新药研发及其发病机制的研究，为推动甲型血友病的研究尤其是甲型血友病的基因治疗莫定基础。

技术特征：

1.一种可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，其特征在于，所述外显子包括第14外显子。

3.根据权利要求2所述的可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，其特征在于，所述第14外显子包含seq id no:1所示的片段且所述片段的第6位核苷酸由a突变为g。

4.根据权利要求3所述的可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，其特征在于，所述甲型血友病模型犬的基因组包含seq id no:3或者seq id no:4所示的片段。

5.根据权利要求2至4任一项所述的可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，其特征在于，点突变的方法包括abemax、crispr/cas9、talen或者zfn。

6.根据权利要求5所述的可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，其特征在于，对犬的受精卵的fviii基因的外显子进行点突变，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，其特征在于，所述建立方法满足如下条件中的一个或者多个：

8.根据权利要求1至4、6和7中任一项所述的可遗传的甲型血友病模型犬的建立方法，其特征在于，所述犬受精卵来自比格犬或/和所述受体母犬为比格犬。

9.权利要求1至8中任一项建立方法建立的可遗传的甲型血友病模型犬的组织或者器官。

10.检测权利要求1至8中任一项建立方法建立的可遗传的甲型血友病模型犬、权利要求9所述的组织或者器官的检测引物对或者包括所述检测引物的试剂盒；所述检测引物对如seq id no:5和seq id no:6所示。

技术总结
本发明涉及一种甲型血友病模型犬的建立方法，所述建立方法包括如下步骤：对犬受精卵的FVIII基因的外显子进行点突变，然后胚胎移植到受体进行发育，从出生幼犬中筛选出甲型血友病犬作为甲型血友病模型犬。相对于传统技术，本申请的有益效果包括：本申请通过对犬受精卵的FVIII基因的外显子进行点突变，然后胚胎移植到受体进行发育，从而构建得到甲型血友病模型犬。采用该方法构建的甲型血友病模型犬是世界上第一例基因编辑甲型血友病模型犬，遗传性能稳定，能够可用于人类甲型血友病治疗新技术的研究，新药研发及其发病机制的研究，为推动甲型血友病的研究尤其是甲型血友病的基因治疗莫定基础。

技术研发人员：赵志宏,吴桂芳,胡敏华,康睿,倪庆纯,松阳洲,汪荣根,梁普平,龙海斌,王家慧
受保护的技术使用者：广州医药研究总院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13