提高固氮微生物活性的协同微生物菌株

背景技术：

1、自然界中的固氮(n)作用是专属于细菌的过程，它通过将空气中的n2气体转化为可用的代谢物来提供生命所需的必要的n。氮可以在微生物群落的各成员之间穿梭，但固氮生物(固氮细菌)也常见于土壤中并与植物相关。一些植物在称为结节的专用结构中容纳固氮细菌，但细菌也可以作为内生菌在植物组织内存活而不会引起疾病。内生菌为植物提供固定的氮，可能以此换取植物提供的糖和其他特殊化的分子。

2、因此，适当的植物微生物组可以高度地改善植物的生长和健康。除n外，内生菌还可以提供磷，并已显示可以提高植物对非生物和生物胁迫的耐受性。

3、只有在过去几年中，使用固氮内生菌产生n的想法才被接受(sharonl.doty.2017.chapter 2:endophytic nitrogen fixation:controversy and a pathforward.in functional importance of the plant endophytic microbiome:implications for agriculture,forestry and bioenergy.sharon l.doty,editor.springer doi:10.1007/978-3-319-65897-1)。现在人们普遍认识到，许多非豆科植物物种具有共生的固n内生菌，并且土壤中经常存在自由存活的固氮生物。这使得利用固氮生物的固n能力成为人们感兴趣的领域。一些农业公司一直在开发固氮的生物接种物，但是仅仅应用单一的固氮菌株并没有导致预期的作物产量的增加。

4、通过需要能量的化学工艺，也可以生产人造n肥。然而，由于高能量投入，这是昂贵的，成本转嫁给消费者或农民。由于在生产中使用化石燃料，土壤细菌将多余的肥料转化为氧化亚氮(一种强效的温室气体)，以及通过渗入水道干扰水生生态系统，因此化肥也对环境产生了负面影响。在热带农业中，这种污染使敏感的珊瑚礁生态系统处于危险之中。

5、因此，仍然需要提供技术来增加微生物生产的固氮的量，以便廉价地生成对环境无毒的氮产品。该方法应广泛适用于改善各种环境中各种植物的氮可及性以及任何需要氮的工业工艺。本发明解决了这一需求和相关需求。

技术实现思路

1、提供此
技术实现要素：
是为了以简化的形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本发明内容不旨在识别所要求保护的主题的关键特征，也不打算用作确定所要求保护的主题范围的辅助手段。

2、根据上文所述，在本发明的一个方面，本发明提供了一种方法，以协同地增加有需要的植物中的氮获取。所述方法可以包括生成用于对有需要的植物进行田间处理的接种物。所述接种物可以包含一种溶液，所述溶液包含有效量的至少一种活的内生菌菌株，其中所述活的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的。所述方法可以进一步包括将接种物应用于有需要的植物，其中所述活的内生菌菌株接触至少一种与所述植物相关的固氮菌株，导致所述固氮菌株的固氮率与在缺少所述活的内生菌菌株时所述固氮菌株的固氮作用率相比更高。

3、在本发明的另一方面，本发明提供了一种协同地增加至少一种活的固氮菌株的固氮作用的方法。所述方法可以包括将至少一种活的内生菌菌株与包含有效量的至少一种活的内生菌菌株的有效量的溶液接触，其中所述活的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离的；以及其中所述活的固氮菌株与所述活的内生菌菌株的接触导致所述活的固氮菌株的固氮率与在缺少所述活的内生菌菌株时所述活的固氮菌株的固氮率相比更高。

4、在本发明的另一方面，本发明提供了一种接种物，所述接种物协同地增加有需要的植物中的氮获取。所述接种物可以包含有效量的源自冻干制剂的溶液，所述冻干制剂包含有效量的至少一种活的分离的内生菌菌株，其中所述活的分离的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的。

5、在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seq id no：1、5和10所示的16s核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seqid no：1所示的16s核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seq id no：5所示的16s核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seq id no：10所示的16s核酸序列。

6、在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seq id no：2-4、6-9和11-14中所示序列的一种或多种标志物。在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seq id no：2-4中所示序列的三种标志物。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seq id no：6-9中所示序列的四种标志物。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seq id no：11-14中所示序列的四种标志物。

7、在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌(sphingobium)物种。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于亲和素链霉菌(herbiconiux)物种。

8、在一些实施方案中，所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是初级基质。在一些实施方案中，所述初级基质是鹅卵石或沙子。在其他实施方案中，所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是熔岩场、沙漠、干旱环境、半干旱环境和/或烧焦的环境之一。

9、在一些实施方案中，所述有需要的植物选自农作物、生物能源农作物、林业树木、园艺植物、香料或药用植物以及草坪草的组。

10、在一些实施方案中，所述接种物包含溶液，所述溶液包含有效量的两种或更多种活的分离的内生菌菌株。

11、在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株的有效量是与不存在所述至少一种活的分离的内生菌菌株时与所述植物相关的固氮菌株的固氮作用率相比，导致与所述植物相关的所述固氮菌株将固氮作用增加至少5％的量。

12、在一些实施方案中，所述接种物可以进一步包含至少一种活的分离的固氮菌株。

13、在一些实施方案中，所述至少一种活的分离的协同内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是0到20的整数。在其他实施方案中，所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1:1+n，其中n是0到20的整数。

14、在一些实施方案中，将所述接种物施用于有需要的植物，并且所述至少一种活的分离的内生菌菌株与至少一种与所述植物相关的固氮菌株接触，导致所述植物相关固氮菌株与在不存在至少一种分离的内生菌菌株时该植物相关固氮菌株的固氮作用率相比以更高的比率固氮。

技术特征：

1.一种在有需要的植物中协同地增加氮获取的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seq idno：1、5和10所示的16s核酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seq idno：1所示的16s核酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seq idno：5所示的16s核酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seq idno：10所示的16s核酸序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seqid no：2-4、6-9和11-14中所示的序列中的一种或多种标志物。

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seqid no：2-4中所示的序列中的三种标志物。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seqid no：6-9中所示的序列中的四种标志物。

9.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seqid no：11-14中所示的序列中的四种标志物。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌(sphingobium)物种。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于亲和素链霉菌(herbiconiux)物种。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌物种。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养受限和/或水分胁迫的环境是初级基质。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述初级基质是鹅卵石或沙子。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是熔岩场、沙漠、干旱环境、半干旱环境和/或烧焦的环境之一。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述有需要的植物选自农作物、生物能源农作物、林业树木、园艺植物、香料或药用植物以及草坪草的组。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述接种物包含含有有效量的两种或更多种活的分离的内生菌菌株的溶液。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株的有效量是与缺少所述至少一种活的分离的内生菌菌株时与所述植物相关的固氮菌株的固氮率相比，导致与所述植物相关的固氮菌株将固氮作用增加至少5％的量。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述接种物可以进一步包含至少一种活的分离的固氮菌株。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是1到20的整数。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的所述比例为1:1+n，其中n是1到20的整数。

22.一种接种物，所述接种物协同地增加有需要的植物中的氮获取，所述接种物包含有效量的源自冻干制剂的溶液，所述冻干制剂包含有效量的至少一种活的分离的内生菌菌株，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株是从营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的。

23.根据权利要求22所述的接种物，其中所述接种物被施用于有需要的植物，并且所述至少一种活的分离的内生菌菌株与至少一种和所述植物相关的固氮菌株接触，导致所述植物相关的固氮菌株与缺少所述至少一种分离的内生菌菌株时与所述植物相关的固氮菌株的固氮率相比以更高的比率固氮。

24.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seqid no：1、5和10所示的16s核酸序列。

25.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seqid no：1所示的16s核酸序列。

26.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seqid no：5所示的16s核酸序列。

27.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含seqid no：10所示的16s核酸序列。

28.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seq id no：2-4、6-9和11-14中所示的序列中的一种或多种标志物。

29.根据权利要求25所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seq id no：2-4中所示的序列中的三种标志物。

30.根据权利要求26所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seq id no：6-9中所示的序列中的四种标志物。

31.根据权利要求27所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株包含选自seq id no：11-14中所示的序列中的四种标志物。

32.根据权利要求29所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌属物种。

33.根据权利要求30所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于亲和素链霉菌属物种。

34.根据权利要求31所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株属于鞘脂菌属物种。

35.根据权利要求22所述的接种物，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是初级基质。

36.根据权利要求35所述的接种物，其中所述初级基质是鹅卵石或沙子。

37.根据权利要求22所述的接种物，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是熔岩场、沙漠、干旱环境、半干旱环境和/或烧焦的环境之一。

38.根据权利要求22所述的接种物，其中所述有需要的植物选自农作物、生物能源农作物、林业树木、园艺植物、香料或药用植物以及草坪草的组。

39.根据权利要求22所述的接种物，其中所述源自冻干制剂的溶液包含有效量的两种或更多种活的分离的内生菌物种。

40.根据权利要求22所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株的有效量是导致所述植物相关的固氮菌株与缺少所述至少一种活的分离的内生菌菌株时所述植物相关的固氮菌株的固氮率相比将固氮作用增加至少5％的量。

41.根据权利要求22所述的接种物，其中所述源自冻干制剂的溶液进一步包含至少一种活的分离的固氮菌株。

42.根据权利要求41所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是1到20的整数。

43.根据权利要求41所述的接种物，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是1到20的整数。

44.一种协同地增加至少一种固氮菌株的固氮作用的方法，所述方法包括，将至少一种固氮菌株与有效量的溶液接触，所述溶液包含有效量的至少一种根据权利要求24-34中任一项所述的活的分离的内生菌菌株，其中所述至少一种活的分离的内生菌是从在营养受限和/或水分受胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离出来的；并且其中将所述活的固氮菌株与所述至少一种活的分离的内生菌菌株接触，导致所述活的固氮菌株与在缺少所述至少一种活的分离的内生菌菌株时所述活的固氮菌株的固氮率相比更高的比率固氮。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是初级基质。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述初级基质是熔岩。

47.根据权利要求44所述的方法，其中所述营养受限和/或水分受胁迫的环境是熔岩场、沙漠、干旱环境、半干旱环境、烧焦的环境和/或高盐度环境之一。

48.根据权利要求44所述的方法，其中所述至少一种活的固氮菌株与植物相关。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述有需要的植物选自农作物、生物能源农作物、林业树木、园艺植物、香料或药用植物以及草坪草的组。

50.根据权利要求44所述的方法，其中所述至少一种活的固氮菌株在微生物制剂中包含分离的培养物。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1+n:1，其中n是1到20的整数。

52.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株与所述至少一种活的分离的固氮菌株的比例为1:1+n，其中n是1到20的整数。

53.根据权利要求44所述的方法，其中所述至少一种活的分离的内生菌菌株的有效量是与缺少所述至少一种活的分离的内生菌菌株时所述固氮菌株的固氮率相比，导致所述固氮菌株将固氮作用增加至少5％的量。

技术总结
本发明的实施方案提供了增加固氮生物的固氮(N)作用或为有需要的植物提高N获取的方法和组合物。所述方法和组合物的实施方案包含至少一种活的内生菌菌株，其中所述活的内生菌菌株是从在营养受限和/或水分胁迫的环境中生长的一种或多种植物中分离的。在一些实施方案中，可以将所述内生菌菌株施用于植物，其中所述内生菌菌株协同地增加与与所述植物相关的固氮菌株的固氮作用。在其他实施方案中，所述固氮菌株与所述植物不相关。本发明的实施方案可以广泛应用于减少肥料需求、增加植物固碳、增加用作能源或化学工业的氢气产量以及增加工业微生物菌株的生长、减少发酵罐中对铵或硝酸盐的需求。

技术研发人员：S·L·多蒂,A·W·谢尔
受保护的技术使用者：华盛顿大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17