非人灵长类动物孤独症模型的构建方法

本发明涉及动物疾病模型，具体涉及一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法。

背景技术：

1、孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，asd)也叫自病症，是一类广泛性发育障碍，严重影响儿童早期发育，主要表现为不同程度的人际交往障碍、刻板行为、语言发育障碍和兴趣狭隘等。研究认为孤独症起因包含遗传和环境因素，遗传因素占25％左右，和孤独症有关的风险基因约800个，具有高度遗传复杂性。

2、chd8基因(chromodomain helicase dna-binding protein 8)在众多孤独症关联突变基因中突变率高达0.5％，是一个重要的候选致病基因。chd8基因位于染色体14q11.2结构域，编码一种染色体结构域解旋酶dna结合蛋白8，该蛋白可与p53、βcatenin等转录因子结合，具有复杂的转录调控作用。临床上chd8突变患者多为杂合突变，患者的主要临床特征包括轻度智力障碍、巨头畸形、社交障碍、肌张力减退、注意力缺陷、攻击行为和癫痫发作等。

3、以人类孤独症患者为研究对象受伦理、实验手段等限制，制约深入解析基因、神经回路、脑区解剖结构和行为之间的相互关系，因此动物模型被广泛用来研究孤独症的发病机理。目前chd8突变的小鼠模型具有较大的表型及病理异质性，不能完全模拟孤独症病人的重要病理及行为特征。考虑到啮齿类动物与灵长类动物大脑在发育及结构上具有明显区别，比如啮齿类动物大脑表面缺乏沟回及缺乏负责灵长类大脑皮层扩张的osvz区域等，因此利用与人类更为接近的猴模型研究chd8基因突变所造成的临床重要病理特征及机制具有重要意义。

4、近些年来，随着crispr/cas9基因编辑技术成熟，mecp2和shank3基因是造成遗传学孤独症的重要基因，已用来构建非人灵长类模型。已公开的孤独症猴模型构建方法采用受精卵打靶建模，此种方法虽然能很好的模拟孤独症风险基因在发育中的作用，但周期长、成本高和脱靶问题难以解决，限制了该方法的广泛应用。采用vpa和mia抗体处理孕期灵长类动物的传统孤独症造模方法，虽然其后代会表现出社交、刻板行为等自闭样行为，但无法模拟某特定致病基因的作用机制。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，通过对chd8sgrna/cas9病毒注射时期和注射部位的改进，获得一种性状明显、稳定的灵长类动物孤独症模型。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，包括以下步骤：

4、在雌性非人灵长类动物妊娠期第55±1天，向其胎儿侧脑室中注射chd8sgrna/cas9病毒，然后正常饲养，待胎儿出生后即获得非人灵长类动物孤独症模型；

5、所述注射chd8 sgrna/cas9病毒的时间，是神经细胞发生增殖分化的重要时期，和chd8基因在脑中表达密切相关。

6、所述的非人灵长类动物优选食蟹猴、猕猴等。

7、所述的chd8 sgrna/cas9病毒，其中sgrna和慢病毒cas9体积比为1：2，病毒滴度为1×109vg/ml，注射量100-200μl，注射速度优选20μl/min；

8、所述的sgrna，是靶向chd8基因的exon 19设计的。

9、所述的正常饲养，是每天两次提供口粮，两次提供时令新鲜水果，饮用水全时供应。

10、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

11、本申请开发了基于胚胎时期脑注射慢病毒载体在非人灵长类动物大脑早期发育(优选胚胎55天)进行chd8基因打靶的建模方法，成功模拟了胚胎期进行chd8基因突变造成灵长类动物大脑胶质细胞增生的重要病理特征，该方法便于批量建模，而目前并没有利用该建模方法研究chd8基因突变在灵长类脑中的早期病理特征的相关报道。且目前已公开的chd8孤独症模型猴模型构建方法多采用抗体处理孕期灵长类动物和受精卵基因编辑方法，抗体处理法不能模拟某特定孤独症相关基因致病机制，而受精卵chd8基因编辑方法致死率高。因此本申请采用胚胎脑基因编辑造成脑组织中chd8基因突变,该项研究为深入探究灵长类脑中孤独症脑发育障碍机理、开发孤独症治疗靶点及临床前药物筛选提供了有效模型及重要方法。

技术特征：

1.非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于：所述的非人灵长类动物为食蟹猴、猕猴。

3.根据权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于：所述的chd8sgrna/cas9病毒，其中sgrna和慢病毒cas9体积比为1：2，病毒滴度为1×109vg/ml。

4.根据权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于：所述的chd8sgrna/cas9病毒，注射量100-200μl，注射速度20μl/min。

5.根据权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于：所述的sgrna，是靶向chd8基因的exon 19设计的。

6.根据权利要求1所述的模型构建方法，其特征在于：所述的正常饲养，是每天两次提供口粮，两次提供时令新鲜水果，饮用水全时供应。

技术总结
本发明公开了一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，该方法包括以下步骤：在雌性非人灵长类动物妊娠期第55±1天，向其胎儿侧脑室中注射CHD8sgRNA/Cas9病毒，然后正常饲养，待胎儿出生后即获得非人灵长类动物孤独症模型。本发明成功模拟了胚胎期进行CHD8基因突变造成灵长类动物大脑胶质细胞增生的重要病理特征，该方法便于批量建模，而目前并没有利用该建模方法研究CHD8基因突变在灵长类脑中的早期病理特征的相关报道。本发明采用胚胎脑基因编辑造成脑组织中CHD8基因突变,该项研究为深入探究灵长类脑中孤独症脑发育障碍机理、开发孤独症治疗靶点及临床前药物筛选提供了有效模型及重要方法。

技术研发人员：李邦,杨伟莉,李晓江,罗涯锋,张家玮,涂著池,郭祥玉,殷鹏,李岳锋
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12