一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法

本发明属于模式生物，具体涉及一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法。

背景技术：

1、在人口日益老龄化的背景下，肥胖和衰老两种重要的疾病已经在世界范围内影响着人类健康。这两种疾病的趋同导致了一种称为肌少性肥胖的独特病理。目前，肌少性肥胖虽然缺乏共识定义，但可以归纳为以下三个标准：(1)低肌肉量；(2)高体脂水平；(3)低身体机能。其主要表现在衰老的过程中，肌肉质量和功能的整体下降，导致虚弱、体力活动下降、丧失独立性等非特异性症状。同时，机体中脂肪细胞的大小和数量增加，从而放大机体的炎症和氧化应激反应。

2、目前，对于肌少性肥胖的研究存在挑战：(1)体重指数(bmi)是肥胖最广泛的测量参数，但局限性在于它测量的是包括肌肉质量在内的总体重，不能提供肌肉力量和和身体表现的评估，且易产生“肥胖悖论”；(2)由于细胞群异质性的未知意义及其内外因素对特定细胞的作用，导致体外细胞实验难以反应真实的疾病状态；(3)动物模型实验周期长，具有伦理约束，操作也较为繁琐且成本较高，对肥胖和衰老关系的估计也存在偏差。

3、秀丽隐杆线虫是一种以细菌为食的小型模式生物，其体型简单、便于观察、寿命较短、试验周期适中、易于繁殖、遗传背景清楚，且线虫实验与哺乳动物实验结果存在良好的正相关性。在秀丽隐杆线虫中，已知约有25个基因可以改变线虫肌肉的正常晶格结构，其中一些基因已被证明编码特异性收缩蛋白，如编码副肌球蛋白的unc-15、编码肌钙蛋白的unc-27以及表达于线虫肌肉m波段的unc-89等，这些特定肌肉基因的突变或表达受阻可能导致线虫身体机能丧失。其次，细胞内脂肪主要的存储部位是脂滴，脂滴是一种普遍存在的细胞器，在酵母、线虫、果蝇以及哺乳动物中保守，衰老过程中线虫脂肪的异常堆积导致脂质毒性，降低其相关组织功能。因此秀丽隐杆线虫可以用来构建肌少性肥胖疾病模型，用于剖析该疾病在不能再生的组织中，与衰老有关的各种压力的关系，从而建立一个有效的抗肥胖和抗衰老化合物或菌株的筛选平台及抗感染的研究工具。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型的建立方法，该方法操作简单，只需替换细菌饮食产生线虫病理特征，不更改培养基条件和常规喂食方式，具有特征明显且方便快速的特点，适用于筛选、研究以及产品开发。

2、本发明的另一目的在于提供一种上述方法建立的秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型；该秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型的特征表现为：线虫取食偏好的改变、寿命缩短、产卵能力和运动能力下降，并出现脂肪含量增加、脂褐质和ros水平上升的现象。基于转录组测序分析，该模型在生物学过程中与肌肉收缩功能下降和脂肪酸代谢异常显著相关，与表型相关性较好，表明该模型具有经济、有效、可行的特点。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型的建立方法，包括以下操作步骤：利用阴沟肠杆菌hj感染经同步化的l4期野生型n2秀丽隐杆线虫，诱导肌少性肥胖的表型，并经转录组测序完成基因关联分析，即为秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型。

5、所述经同步化的l4期野生型n2秀丽隐杆线虫的获得按照以下步骤：用m9缓冲液收集妊娠期线虫，经裂解、离心、沉淀、清洗后，置于20℃下培养12h获得l1期线虫；将l1期虫转移至含有大肠杆菌op50的ngm平板上培养52-60h，获得l4期线虫。

6、所述裂解使用的裂解液是体积比1：1的1m naoh和naclo溶液原液的混合液。

7、所述阴沟肠杆菌hj感染是利用阴沟肠杆菌hj代替线虫实验室标准喂食菌株大肠杆菌op50，将经同步化的l4期野生型n2秀丽隐杆线虫转移至感染板，使其自由觅食。

8、所述阴沟肠杆菌hj是从菌种保藏甘油管中挑取适当菌液进行平板划线，挑取单菌落接种于lb液体培养基，以180r/min，37℃活化培养14-16h，去除培养液，收集活化后的菌体，用无菌m9缓冲液清洗并重悬，调整阴沟肠杆菌hj浓度为107-109cfu/ml，得到阴沟肠杆菌hj应用菌液。

9、所述感染板是根据上述步骤获得浓度为109cfu/ml的阴沟肠杆菌hj应用菌液，吸取100μl菌液滴加于洁净的ngm平板中央，在无菌环境下晾干后，形成一层菌膜，即为感染板，置于4℃冰箱保存待用。

10、所述肌少性肥胖的表征包括以下步骤：检测线虫对阴沟肠杆菌hj的取食偏好，以及在浓度为109cfu/ml的阴沟肠杆菌hj制备的感染板中线虫的存活率、产卵量、脂肪含量和运动能力以及脂褐素和细胞活性氧水平。

11、一种由上述的建立方法构建的秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型。

12、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

13、(1)造模方法简便：一些造模操作需要改变培养条件，会破坏线虫的正常生长环境，增加格外的干扰因素，影响实验准确性。本发明提供的一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法只需改变线虫的细菌饮食可完成建模步骤，操作更为简便，避免化学药物或物理刺激带来的不必要的影响。

14、(2)结果可信：秀丽隐杆线虫本身具有食菌性，依靠细菌营养进行生长和发育，其次不同细菌饮食会影响线虫的取食趋向，采用趋向率较高的细菌饮食，能确保细菌成功被线虫摄入，避免饥饿效应。

15、(3)模型适用性较好：本发明提供的秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型不仅仅可以对在线虫体内脂肪含量进行检测，还可以对肥胖发展过程中的关键影响因素进行探究，并且结合真核转录组测序阐明模型建立机制，提供了一个遗传上统一，可用于研究肥胖、老龄化以及死亡率之间的多重交集的模型。

技术特征：

1.一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型的建立方法，其特征在于包括以下操作步骤：利用阴沟肠杆菌hj感染经同步化的l4期野生型n2秀丽隐杆线虫，诱导肌少性肥胖的表型，并经转录组测序完成基因关联分析，即为秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述同步化l4期的秀丽隐杆线虫的获得按照以下步骤：用m9缓冲液收集妊娠期线虫，经裂解、离心、沉淀、清洗后，置于20℃下培养12h获得l1期线虫；将l1期虫转移至含有大肠杆菌op50的ngm平板上培养52-60h，获得l4期线虫。

3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于：所述裂解使用的裂解液是体积比1：1的1m naoh和naclo溶液原液的混合液。

4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：所述阴沟肠杆菌hj感染是利用阴沟肠杆菌hj代替线虫实验室标准喂食菌株大肠杆菌op50，将经同步化的l4期野生型n2秀丽隐杆线虫转移至感染板，使其自由觅食。

5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于：所述阴沟肠杆菌hj在使用之前是从菌种保藏甘油管中挑取适当菌液进行平板划线，挑取单菌落接种于lb液体培养基，以180r/min，37℃活化培养14-16h，去除培养液，收集活化后的菌体，用无菌m9缓冲液清洗并重悬，调整阴沟肠杆菌hj浓度为107-109cfu/ml，得到阴沟肠杆菌hj应用菌液。

6.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于：所述感染板是根据权利要求5的步骤获得浓度为109cfu/ml的阴沟肠杆菌hj应用菌液，吸取100μl菌液滴加于洁净的ngm平板中央，在无菌环境下晾干后，形成一层菌膜，即为感染板，置于4℃冰箱保存待用。

7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：所述肌少性肥胖的表征包括以下步骤：检测线虫对阴沟肠杆菌hj的取食偏好，以及在浓度为109cfu/ml的阴沟肠杆菌hj制备的感染板中线虫的存活率、产卵量、脂肪含量和运动能力以及脂褐素和细胞活性氧水平。

8.一种由权利要求1-7任一项所述的建立方法构建的秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型。

技术总结
本发明属于模式生物技术领域，公开了一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法。该线虫模型中具有明显的“早衰”现象，并与肌肉功能下降和脂肪酸代谢异常紧密联系，符合肌少性肥胖特征。建立步骤包括：线虫同期化处理；线虫肌少性肥胖模型的构建和表征；线虫模型的基因关联分析。本发明基于线虫的取食偏好，利用阴沟肠杆菌HJ替换常规细菌饮食(大肠杆菌OP50)，损害其身体机能，显示出低肌肉力量。诱发线虫脂质积累，促进脂褐质和ROS水平的过表达。进一步通过转录组测序完善该模型的基因关联分析。本发明提供的一种秀丽隐杆线虫肌少性肥胖模型及其建立方法对于肥胖的研究以及相关药物、食品以及保健品的筛选和开发具有重要意义。

技术研发人员：方祥,邓晶,袁玥,林海彬,蔡敏瑜,董飒爽,廖振林,王洁
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12