一种获得元宝枫无菌苗及直接诱导无菌芽的方法

本发明属于元宝枫组织培养领域，具体涉及一种元宝枫种胚外植体消毒方法及其无菌苗带芽茎段直接诱导无菌芽快速增殖的方法。

背景技术：

1、元宝枫(acer truncatum bunge)属槭树科槭属(acer)落叶小乔木，又名华北五角枫、平基槭，是中国特有树种，因其翅果形似中国古代的金锭元宝而得名。树高8～20m，主要分布于我国的黄河流域。元宝枫作为我国特有经济树种，因其种仁含油量高、生态适应性强、经济价值高，被确定为一种优良的木本油料树种；又因籽油含有能促进受损神经组织修复和再生的特效物质——“神经酸”，并于2011年3月22日，中华人民共和国卫生部第9号文件，批准元宝枫籽油为新资源食品，自此元宝枫籽油正式进入我国食用植物油行列，进一步促进了元宝枫产业的发展。2017年元宝枫被国家林业和草原局确定为珍贵木本油料树种。目前，关于元宝枫组织培养的报道还很少，元宝枫组织培养还处于起步阶段。本发明主要从元宝枫外植体的消毒、萌发培养、继代培养、腋芽诱导培养等一系列过程，快速获得了元宝枫组培苗，大大缩短了元宝枫的育种周期，且操作简单，无菌芽苗长势良好，污染率低，为元宝枫的工厂化育苗及转基因技术提供可能。

2、目前，元宝枫的组织培养技术研究已有报道，如下：

3、201210221749.x一种元宝枫的组织培养方法

4、202010729421.3一种元宝枫快速成苗方法

5、202011030208.x一种促进元宝枫种子萌发的方法

6、本发明与上述专利一一相比的优势在于操作简便、培养周期短，培养基的配方简单，所需成本低，关键是特别适合元宝枫的快繁。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是针对目前元宝枫种子灭菌不彻底问题，提供一种消毒方法。该消毒方法简单高效，灭菌效果好，为元宝枫的组培快繁体系建立打下坚实基础。

2、一种元宝枫种子消毒的方法，包括以下步骤：

3、(1)外植体采集：成熟、饱满、无病虫害的元宝枫种子

4、(2)外植体处理：将采集的元宝枫种子置于4℃冰箱冷藏，1d后取出。加入适量洗衣粉，将其置于自来水下冲洗20～50min后将外种皮剥去，继续冲洗1h，最后用无菌水清洗3～5次。

5、(3)外植体消毒：将用无菌水洗净后的外植体置于超净工作台中，使外植体浸泡在体积浓度为70％的酒精溶液中30～60s，用无菌水冲洗3次。再将元宝枫种子置于体积浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3～10min(具体时间根据种皮的木质化程度而定)，无菌水反复清洗5～8次。最后将其置于无菌滤纸上，以吸收种子表面多余的水分。

6、仅采用一种消毒剂对元宝枫种子进行消毒的效果不太理想，必须用体积浓度为70％的酒精和0.1％升汞共同处理外植体材料，并用无菌水多次清洗种子表面残留的消毒剂，才可能达到理想的消毒灭菌效果。且进行消毒时要保留元宝枫种子的内种皮，否则会使元宝枫种子的活力大大降低，导致其萌发困难。

7、本发明的第二个目的是提供元宝枫幼嫩带芽茎段外植体直接诱导产生丛生芽的方法,该方法通过带芽茎段外植体直接诱导腋芽，诱导率高，生长状况好，为元宝枫的的工厂化育苗及以后转基因技术打下了基础。

8、一种元宝枫无菌苗带芽茎段直接诱导无菌芽快速增殖的方法，包括以下步骤：

9、腋芽诱导培养：将元宝枫无菌苗置于超净工作台中，剪去叶片，留下1cm长叶柄。将其切成至少带一个腋芽，长1～3cm的带芽茎段。将带单芽的元宝枫茎段接种到ms+1.0～5.0mg/l 6-ba+0.1～0.5mg/l iba的培养基中进行腋芽诱导培养。暗培养后转到光照条件下进行培养。

10、上述方法中，培养温度为24士2℃，光照培养强度为2100～2200lx，光照培养时间12～15h/d。

11、上述方法中腋芽诱导的培养基优选为：ms+3.0mg/l 6-ba+0.1mg/l iba。

12、上述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ph调至5.5～5.8。

13、此外，元宝枫组织培养的研究比较少见。本发明的区别及优势总结如下：

14、1.本发明利用元宝枫种胚成功的培育出了无菌苗，只需要30d就可以得到完整的无菌苗。从而缩短了育苗周期，节省育苗材料，克服了传统育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期长等问题，大大降低了生产成本，提高了生产效率。无菌苗具有生长周期短，分枝多，生根率高且根系较多，组培苗生长健壮的特点。

15、2.本发明在进行腋芽诱导时直接采用无菌苗的茎段，既保证了带芽茎段的活力，又避免了从外界二次采样带来的外植体污染，从而节省了时间，也避免了外植体材料的浪费。

16、3.本发明直接由元宝枫带芽茎段诱导无菌芽，显著节省了无菌芽的获得时间，且获得的无菌芽健壮、有活力，形成了一套适合元宝枫组培苗无菌芽组织培养前期快繁技术体系，为元宝枫的工厂化育苗及以后基因工程改良打下了基础。

17、4.本发明前期采用传统配方对元宝枫种子进行萌发培养，发现无菌苗长势差且分枝少，叶片数较少，不利于后期的继代增殖培养。在腋芽诱导培养方面，利用原始的配方发现腋芽生长情况较差，不利于用作后期的继代、生根和炼苗移栽。本发明调节了培养基的配方后，大大提高了元宝枫组培苗分枝支数及长势。

18、5.本发明通过大量试验得到了适合元宝枫种胚萌发、带芽茎段腋芽诱导的配方，极大的提高了腋芽的分化率，获得了生长健壮的元宝枫组培苗。

19、6.本发明在腋芽诱导时，并未采用传统的方法将带芽茎段竖着插入培养基中，而是将茎段平铺在培养基上，使茎段和培养基的接触表面积有很大程度的增加，更便于营养物质和水分的运输。

技术特征：

1.一种元宝枫种子外植体消毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.一种快速得到元宝枫无菌苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：将消毒完毕的元宝枫种子置于无菌滤纸上吸干水分后，用手术刀和镊子小心的挑开内种皮，分离合子胚轴和子叶，将合子胚轴接入培养基中进行萌发培养。

3.一种诱导元宝枫带芽茎段快速增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求2所述的元宝枫种胚无菌苗的获得的方法，其特征在于，暗处理3d后转至光照条件下培养28～35d。

5.根据权利要求2所述的元宝枫种胚无菌苗的获得的方法，其特征在于，种胚萌发使用的培养基为：ms+0.5～2.0mg/l 2,4-d。

6.根据权利要求3所述的元宝枫带芽茎段快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(2)中腋芽诱导使用的培养基为ms+1.0～5.0mg/l 6-ba+0.1mg/liba。

7.根据权利要求3所述的元宝枫带芽茎段快速增殖的方法，其特征在于，步骤(2)暗处理3d后转至光照条件下培养28～35d。

8.根据权利要求2、3所述的方法，其特征在于，培养温度为24士2℃，光照培养强度为2100-2200lx，光照培养时间12-15h/d。

9.根据权利要求2、3所述的元宝枫快速繁殖的方法，其特征在于，所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/l，pvp(聚乙烯吡咯烷酮)0.75mg/l，琼脂7g/l，ph调至5.5-5.8。

技术总结
本发明提供了一种元宝枫种胚获得无菌苗和无菌苗带芽茎段直接诱导腋芽的方法，包括外植体的消毒、萌发培养、继代培养、腋芽诱导培养。本发明具有外植体污染率低、繁殖速度快、培育周期短的优点，不仅为快速繁殖优良无菌苗提供了一条途径，也为工厂化育苗及遗传转化体系建立提供了可能。

技术研发人员：李玲俐,王珊,陈转香,洪心悦,张博勇,马建文,辛好东
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13