本发明属于水产动物遗传改良中贝类染色体组工程育种，具体涉及一种高效、快速的牡蛎纯系制种方法。
背景技术：
1、纯系(pure line)，又称克隆(clone)，是遗传上均一的纯结合个体所组成的系统的总称。一般由所有有关基因均为纯合体的个体进行自交，或是通过长期的连续近亲交配而产生。因此，同属于一个纯系的个体，基因型全部相同。其所表现的变异乃是环境作用的结果，不会遗传给后代，只有突变才能使之有新的发展变化。实际上要育成具有严格科学标准的纯系很不容易的，所以通常只着眼于有关的基因范围内的纯系化，认为在其他基因方面只要不存在十分明显的变异即算作纯系。
2、对于水产动物而言，纯系制作在鱼类上获得了成功，尤其是采用雌核发育1-2次，即可以获得纯系。但是，在贝类育种上，纯系研究尚无相关报道。报道较多的，是接近于纯系的雌核发育系，但是对于牡蛎、扇贝、鲍鱼等贝类的雌核发育系的研究仅仅停留在胚胎或者幼虫阶段，尚未见到雌核发育系成体的相关报道，也就是说，仅仅有胚胎，不能获得性成熟的成体，那就是没有育种材料，导致接下来的育种工作无法进展，这严重制约了牡蛎育种技术突破及其新品种创制途径。为此，有必要构建一套贝类纯系的制备技术，填补国际空白，实现作物中的“扦插式”育种模式，推进我国贝类育种技术在此领域的零突破，创制更多“新、特、奇”的新品种。
技术实现思路
1、本发明的目的是创制一种高效、快速的牡蛎纯系制种技术，旨在培育出可以作为亲本的纯系材料，进一步开展遗传育种研究，为其纯系制备及其纯系间其杂种优势利用提供技术保障。
2、本发明的高效、快速的牡蛎纯系制种方法，其特征在于，包括以下步骤：
3、a、雌核发育幼虫制备：首先解剖二倍体牡蛎，解剖获取卵子，获得卵液，将卵液利用海水激活；四倍体牡蛎的精子在紫外线照射下，使得精子遗传物质失活，但是具有激发受精能力条件，获得灭活精子；将灭活精子加入到激活的卵液中，当受精卵有30-50％释放第一极体的时候，加入细胞松弛素b处理，受精卵液的cb浓度控制在0.3-0.5mg/l，再洗受精卵，放入孵化容器中进行孵化；受精卵发育至d形幼虫；利用流式细胞仪检测幼虫倍性，产生的二倍体均为雌核发育幼虫、三倍体均为正常受精尚未抑制住第二极体的幼虫、四倍体为均为正常受精抑制住第二极体的幼虫；
4、b、幼虫超低密度培育：将雌核发育幼虫选育出来，二倍体比率在70％以上组合进行幼虫培育，培育过程中，控制投饵料，确保幼虫能吃饱且不超量，当幼虫发育至眼点阶段，此时，投放附着基采苗，获得雌核发育系稚贝；
5、c、子代培养及其鉴定：雌核发育系稚贝经稚贝培养、幼贝育成及其成体养殖，对子代成体进行倍性鉴定，其中，二倍体均为雌核发育子代，剔除掉其中三倍体、四倍体及其非整倍体；鉴定好的雌核发育子代进行养成；
6、d、二次雌核发育建立纯系：当一代雌核发育子代性腺成熟时，重复步骤a，制造卵液；利用灭活的四倍体牡蛎精子与其受精，当其受精卵30-50％出现第一极体时，加入细胞松弛素b处理，处理浓度为0.3-0.5mg/l，再洗受精卵，放入孵化容器中进行孵化；受精卵发育至雌核发育二代的d形幼虫；利用流式细胞仪检测幼虫倍性，产生的二倍体均为雌核发育幼虫、三倍体均为正常受精尚未抑制住第二极体的幼虫、四倍体为均为正常受精抑制住第二极体的幼虫；之后继续重复步骤b-c，获得雌核发育二代子代，当其发育至成体阶段，利用流式细胞仪将二倍体筛选出来，剔除掉其他倍性个体，即连续两代的雌核发育系，即获得了纯系。
7、优选，所述的雌核发育幼虫制备为：利用四倍体牡蛎的精子作为激活二倍体卵子的来源，首先解剖二倍体牡蛎，筛选出卵子质量较高的个体，解剖获取卵子，利用500目筛绢网洗卵2-3次，之后利用200目筛绢网过滤，获得卵液，将卵液利用海水激活30-60min；四倍体牡蛎的精子在紫外线照射下，使精子遗传物质失活，但是具有激发受精能力条件；将灭活精子加入到激活的卵液中，当受精卵有30-50％释放第一极体的时候，加入溶解好的细胞松弛素b，受精卵液的cb浓度控制在0.3-0.5mg/l，处理后利用500亩筛绢网洗受精卵1-2次，放入孵化容器中进行孵化；经过16-20h，受精卵发育至d形幼虫；利用流式细胞仪检测幼虫倍性，产生的二倍体均为雌核发育幼虫、三倍体均为正常受精尚未抑制住第二极体的幼虫、四倍体为均为正常受精抑制住第二极体的幼虫；
8、优选，所述的幼虫超低密度培育为：将雌核发育幼虫用300目筛绢网选育出来，二倍体比率在70％以上组合进行幼虫培育；通常情况下，雌核发育获得子代为正常孵化获得的千分之几至万分之几，所以一般获得的幼虫量比较少，培育密度控制在1个幼虫/100-200ml海水中；培育过程中，控制投饵料，确保幼虫能吃饱且不超量，其他步骤同牡蛎幼虫培育常规操作；经过15-25d培育，部分幼虫发育至眼点阶段，此时，投放附着基采苗；大约经过5-7天，完成采苗，获得雌核发育系稚贝；
9、优选，所述的子代培养及其鉴定：雌核发育系稚贝经过稚贝培养、幼贝育成及其成体养殖，在子代壳高生长4-5cm时，将获得的子代进行无损伤取样，进行倍性鉴定，其中，二倍体均为雌核发育子代，剔除掉其中三倍体、四倍体及其非整倍体；鉴定好的雌核发育子代按照常规操作养成；
10、优选，所述的二次雌核发育建立纯系：当一代雌核发育子代性腺成熟时，筛选出卵子较好的雌性个体，重复步骤a，制造卵液；利用灭活的四倍体精子与其受精，当其受精卵30-50％出现第一极体时，加入细胞松弛素b，处理浓度为0.3-0.5mg/l，处理后，用500目筛绢网洗受精卵1-2次，之后放入孵化容器；大约经过16-20h，获得了雌核发育二代幼虫；利用流式细胞仪检测幼虫倍性，产生的二倍体均为雌核发育幼虫、三倍体均为正常受精尚未抑制住第二极体的幼虫、四倍体为均为正常受精抑制住第二极体的幼虫；之后继续重复步骤b-c，获得雌核发育二代子代，当其发育至成体阶段，利用流式细胞仪将二倍体筛选出来，剔除掉其他倍性个体，即连续两代的雌核发育系，即获得了纯系。
11、优选，所述的二倍体牡蛎是二倍体葡萄牙牡蛎，所述的四倍体牡蛎是四倍体长牡蛎。
12、本发明利用四倍体精子作为雄性来源进行雌核发育诱导，解决以往靠雌核发育系和正常受精子代均为二倍体的难以区分或者区分不准的难题，实现了仅仅通过倍性检测就可以鉴别雌核发育子代的目的。通过超低密度培养，获得了真正意义上的雌核发育子代成体，解决了全球尚无贝类雌核发育成体“瓶颈”技术难题，填补了国际空白。通过连续两代雌核发育技术，扭转了以往认为雌核发育系无法存活的现状，在全世界第一次获得了经过遗传鉴定的贝类纯系，促使我国在该领域达到了国际领跑水平。作为一项颠覆性技术，本发明不仅仅为贝类纯系制种、纯系维护、纯系间杂交获得显著杂种优势提供了技术保障，还为其纯系生物学机理机制研究提供了宝贵的科研材料，也为贝类纯系生物学研究开辟了一个新方向。
1.一种高效、快速的牡蛎纯系制种方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的牡蛎纯系制种方法，其特征在于，所述的雌核发育幼虫制备为：利用四倍体牡蛎的精子作为激活二倍体卵子的来源，首先解剖二倍体牡蛎，筛选出卵子质量较高的个体，解剖获取卵子，利用500目筛绢网洗卵2-3次，之后利用200目筛绢网过滤，获得卵液，将卵液利用海水激活30-60min；四倍体牡蛎的精子在紫外线照射下，使精子遗传物质失活，但是具有激发受精能力条件；将灭活精子加入到激活的卵液中，当受精卵有30-50％释放第一极体的时候，加入溶解好的细胞松弛素b，受精卵液的cb浓度控制在0.3-0.5mg/l，处理后利用500亩筛绢网洗受精卵1-2次，放入孵化容器中进行孵化；经过16-20h，受精卵发育至d形幼虫；利用流式细胞仪检测幼虫倍性，产生的二倍体均为雌核发育幼虫、三倍体均为正常受精尚未抑制住第二极体的幼虫、四倍体为均为正常受精抑制住第二极体的幼虫。
3.根据权利要求1所述的牡蛎纯系制种方法，其特征在于，所述的幼虫超低密度培育为：将雌核发育幼虫用300目筛绢网选育出来，二倍体比率在70％以上组合进行幼虫培育；培育密度控制在1个幼虫/100-200ml海水中；培育过程中，控制投饵料，确保幼虫能吃饱且不超量，经过15-25d培育，部分幼虫发育至眼点阶段，此时，投放附着基采苗；经过5-7天，完成采苗，获得雌核发育系稚贝。
4.根据权利要求1所述的牡蛎纯系制种方法，其特征在于，所述的子代培养及其鉴定：雌核发育系稚贝经过稚贝培养、幼贝育成及其成体养殖，在子代壳高生长4-5cm时，将获得的子代进行无损伤取样，进行倍性鉴定，其中，二倍体均为雌核发育子代，剔除掉其中三倍体、四倍体及其非整倍体；鉴定好的雌核发育子代按照常规操作养成。
5.根据权利要求1所述的牡蛎纯系制种方法，其特征在于，所述的二次雌核发育建立纯系：当一代雌核发育子代性腺成熟时，筛选出卵子较好的雌性个体，重复步骤a，制造卵液；利用灭活的四倍体精子与其受精，当其受精卵30-50％出现第一极体时，加入细胞松弛素b，处理浓度为0.3-0.5mg/l，处理后，用500目筛绢网洗受精卵1-2次，之后放入孵化容器；经过16-20h，获得了雌核发育二代幼虫；利用流式细胞仪检测幼虫倍性，产生的二倍体均为雌核发育幼虫、三倍体均为正常受精尚未抑制住第二极体的幼虫、四倍体为均为正常受精抑制住第二极体的幼虫；之后继续重复步骤b-c，获得雌核发育二代子代，当其发育至成体阶段，利用流式细胞仪将二倍体筛选出来，剔除掉其他倍性个体，即连续两代的雌核发育系，即获得了纯系。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的牡蛎纯系制种方法，其特征在于，所述的二倍体牡蛎是二倍体葡萄牙牡蛎，所述的四倍体牡蛎是四倍体长牡蛎。