一种γδT细胞保存液的制备方法与流程

本发明涉及细胞保存液领域，特别涉及一种γδt细胞保存液的制备方法。

背景技术：

1、按t细胞表面受体(tcr)的不同，t细胞可分为αβt细胞和γδt细胞，其中，αβt细胞占t细胞总数的95％以上，γδt细胞则至占t细胞总数的2-5％，且主要分布于黏膜相关淋巴组织中。在过去研究中，人们对γδt细胞的功能及认知有限，但随着生物技术的快速发展，γδt细胞的生理功能和作用机制却被不断发现。研究发现，γδt细胞所具备的非mhc限制杀伤肿瘤细胞的特征使之可以成为一种理想的细胞制剂原料，可以在无抗原呈递细胞(apc细胞)的作用下，直接启动对肿瘤细胞的杀伤，并且对有免疫逃逸倾向低表达mhc分子的肿瘤细胞，也具备良好的杀伤效果。

2、为了提高γδt细胞活性，维持γδt细胞的杀伤效果，避免γδt细胞在运输中细胞损伤，提出一种γδt细胞保存液的制备方法。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出一种γδt细胞保存液的制备方法，解决上述问题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种γδt细胞保存液，所述γδt细胞保存液按重量百分比计原料包括3-5％人血蛋白、0.6-0.8％的低分子右旋糖苷、1-1.3％的氨基酸、2-4％的石榴皮提取物、0.4-0.5％的维生素e、3-6％的光果甘草提取物、0.3-0.5％的小檗碱和余量生理盐水。

4、进一步的，所述氨基酸为精氨酸和/或赖氨酸。

5、进一步的，所述氨基酸为质量比为2-3:1的精氨酸和赖氨酸。

6、进一步的，所述石榴皮提取物的制备方法包括以下步骤：

7、(1)将石榴皮粉碎，制得的石榴皮粉末，石榴皮粉末用甲醇粗提，收集滤渣和滤液；

8、(2)滤渣加5-7倍量的水浸提，制得水提取液；

9、(3)合并滤液和水提取液，浓缩，加入无水乙醇醇沉，收集上清液；

10、(4)上清液采用大孔树脂洗脱，收集洗脱液，干燥，制得石榴皮提取物。

11、进一步的，步骤(1)中，所述石榴皮粉末和甲醇质量比为1:5-8，粗提时间为1-3h，粗提次数为2-3，步骤(2)中，所述浸提时间为30-60min，浸提温度为50-60℃，浸提次数为2-3次。

12、进一步的，步骤(3)中，所述大孔树脂洗脱为先用水洗脱除杂，水的用量为2-3个柱体积；再用体积比为1:1.5-2.5的氯仿和甲醇混合液进行洗脱，氯仿和甲醇混合液用量为7-9个柱体积。

13、进一步的，所述光果甘草提取物的制备方法包括以下步骤：

14、(1)将光果甘草粉碎，制得光果甘草粉末，加水浸泡，回流提取，制得回流液；

15、(2)回流液使用大孔树脂柱层析分离，制得分离液；

16、(3)分离液采用正相硅胶柱层析分离，制得洗脱液，干燥，制得光果甘草提取物。

17、进一步的，步骤(1)中，所述光果甘草粉末和水的质量比为1:8-10，浸泡时间为30-40min，回流时间为2-3h。

18、进一步的，步骤(2)中，所述大孔树脂柱层析分离为采用浓度为50-60wt％的乙醇溶液进行洗脱，乙醇溶液用量为7-10个柱体积。

19、进一步的，步骤(3)中，所述正相硅胶柱层析分离采用体积比为10:3-5的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，石油醚和乙酸乙酯混合液用量为10-12个柱体积。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、本发明γδt细胞保存液按重量百分比计原料包括3-5％人血蛋白、0.6-0.8％的低分子右旋糖苷、1-1.3％的氨基酸、2-4％的石榴皮提取物、0.4-0.5％的维生素e、3-6％的光果甘草提取物、0.3-0.5％的小檗碱和余量生理盐水。本发明中通过特点的制备方法能够石榴皮和光果甘草中有效成分，如黄酮类、鞣质类等，能够减少细胞体外损伤、氧化等问题。本发明γδt细胞保存液组分能够提供足够的能量，保持细胞酸碱平衡，防止γδt细胞氧化、损伤和失活，本发明的γδt细胞保存液能够在168h试验下γδt细胞存活率高达90％以上，经过168h，γδt细胞杀伤活性对thp-1细胞杀伤率为26％，本发明制得的γδt细胞保存液能够保证γδt细胞体外活性，经过长时间的保存对肿瘤细胞仍具有很好的杀伤功能表达。

技术特征：

1.一种γδt细胞保存液，其特征在于：所述γδt细胞保存液按重量百分比计原料包括3-5％人血蛋白、0.6-0.8％的低分子右旋糖苷、1-1.3％的氨基酸、2-4％的石榴皮提取物、0.4-0.5％的维生素e、3-6％的光果甘草提取物、0.3-0.5％的小檗碱和余量生理盐水。

2.如权利要求1所述的γδt细胞保存液，其特征在于：所述氨基酸为精氨酸和/或赖氨酸。

3.如权利要求1所述的γδt细胞保存液，其特征在于：所述氨基酸为质量比为2-3:1的精氨酸和赖氨酸。

4.如权利要求1所述的γδt细胞保存液，其特征在于：所述石榴皮提取物的制备方法包括以下步骤：

5.如权利要求1所述的γδt细胞保存液，其特征在于：所述光果甘草提取物的制备方法包括以下步骤：

6.如权利要求4所述的γδt细胞保存液，其特征在于，步骤(1)中，所述石榴皮粉末和甲醇质量比为1:5-8，粗提时间为1-3h，粗提次数为2-3，步骤(2)中，所述浸提时间为30-60min，浸提温度为50-60℃，浸提次数为2-3次。

7.如权利要求4所述的γδt细胞保存液，其特征在于，步骤(3)中，所述大孔树脂洗脱为先用水洗脱除杂，水的用量为2-3个柱体积；再用体积比为1:1.5-2.5的氯仿和甲醇混合液进行洗脱，氯仿和甲醇混合液用量为7-9个柱体积。

8.如权利要求5所述的γδt细胞保存液，其特征在于，步骤(1)中，所述光果甘草粉末和水的质量比为1:8-10，浸泡时间为30-40min，回流时间为2-3h。

9.如权利要求5所述的γδt细胞保存液，其特征在于，步骤(2)中，所述大孔树脂柱层析分离为采用浓度为50-60wt％的乙醇溶液进行洗脱，乙醇溶液用量为7-10个柱体积。

10.如权利要求5所述的γδt细胞保存液，其特征在于，步骤(3)中，所述正相硅胶柱层析分离采用体积比为10:3-5的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，石油醚和乙酸乙酯混合液用量为10-12个柱体积。

技术总结
本发明提供一种γδT细胞保存液的制备方法，γδT细胞保存液按重量百分比计原料包括3‑5％人血蛋白、0.6‑0.8％的低分子右旋糖苷、1‑1.3％的氨基酸、2‑4％的石榴皮提取物、0.4‑0.5％的维生素E、3‑6％的光果甘草提取物、0.3‑0.5％的小檗碱和余量生理盐水。本发明中通过特点的制备方法能够石榴皮和光果甘草中有效成分，如黄酮类、鞣质类等，能够减少细胞体外损伤、氧化等问题。本发明的γδT细胞保存液能够在168h试验下γδT细胞存活率高达90％以上，经过168h，γδT细胞杀伤活性对THP‑1细胞杀伤率为26％，本发明制得的γδT细胞保存液能够保证γδT细胞体外活性，经过长时间的保存对肿瘤细胞仍具有很好的杀伤功能表达。

技术研发人员：齐国光,湛振键,李妖绕,刘林,彭大为,蔡秋雨,郑世鑫,姜莉,李俊,齐航,刘世豪
受保护的技术使用者：河南润盾生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13