一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂及其制备方法

本发明涉及抗菌剂制备领域，尤其涉及一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂及其制备方法。

背景技术：

1、青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)导致的烟草青枯病给我国烟草生产带来了毁灭性的损失，成为制约烟草发展的重要问题。烟草青枯雷尔氏菌具有遗传多样性和复杂性，目前尚无有效防治措施。

2、噬菌体可自由侵入病原微生物中，通过尾鞘侵入宿主细胞后，立即将自身的核酸注入到细胞中，并利用宿主菌的遗传物质在短时间内开始大量的增殖，增殖到一定数量后可以裂解宿主菌致其死亡。但噬菌体侵入青枯雷尔氏菌后的遗传物质增殖缓慢，使得噬菌体的增殖速度大大减缓，不能有效的去除青枯雷尔氏菌。

3、铜基纳米材料是研究较为广泛的一类金属纳米材料。由于其对病原微生物的作用位点多样，有别于传统的作用位点单一的铜制剂杀菌剂。纳米氧化铜释放的cu2+和其本身均会引起氧化胁迫的发生，产生ros，增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等细胞内氧化应激相关酶的活性，引起蛋白质变性，最终致使组织细胞发生损伤，导致线粒体膜受损，破坏电子传递链的功能，并导致细胞死亡。但是纳米氧化铜作用于病原微生物时需要达到较高的浓度后才能起到杀菌作用，这主要是因为微生物自身对有害物质的抵御，限制了纳米氧化铜进入病原微生物中发生一系列作用，进而使得杀菌能力减弱，但是高浓度的纳米氧化铜在生物体的个体水平、细胞水平、基因水平上均有毒性影响，难以实现规模化应用。因此，急需一种新型的烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂，解决纳米氧化铜杀菌过程中难以进入病原微生物中引起氧化胁迫的发生和蛋白质变性，使得杀菌能力大幅降低，难以实现规模化应用的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂及其制备方法，来解决纳米氧化铜杀菌过程中难以进入病原微生物中引起氧化胁迫的发生和蛋白质变性，进而使得杀菌能力降低的问题。

2、本发明通过提供一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂来解决上述技术问题，烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备原料包括：纳米氧化铜、羧基化聚乙二醇、无水乙醇、噬菌体、n-羟基琥珀酰亚胺酯、二甲基亚砜、氢氧化钠溶液。

3、进一步，所述纳米氧化铜的粒径为40-80nm。

4、进一步，所述噬菌体为有尾噬菌体目，短尾噬菌体科噬菌体中的一种或多种。

5、此外本发明还提供了一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备方法，具体如下：

6、s1.纳米氧化铜羧基化：将纳米氧化铜加入到无水乙醇中在80-120khz条件下超声分散30-60min后，加入羧基化聚乙二醇搅拌2-3h，随后于6000-10000rpm/min条件下离心分离5-15min取沉淀，于60-80℃条件下鼓风干燥得到羧基化纳米氧化铜；

7、s2.噬菌体活化：二甲基亚砜用氢氧化钠溶液调节ph值至8-9后加入噬菌体中，得到噬菌体溶液，噬菌体溶液滴度为1×108pfu/ml，随后加入n-羟基琥珀酰亚胺酯搅拌5-6h得到活化后的噬菌体混合液；

8、s3.烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂制备：将羧基化纳米氧化铜加入活化后的噬菌体混合液中，在80-120khz条件下超声分散，超声分散时间为5-15min，分散后搅拌反应1-2h，于6000-10000rpm/min条件下离心分离5-10min取沉淀，-56℃条件下冷冻干燥得烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂。

9、进一步，所述步骤s1中纳米氧化铜、羧基化聚乙二醇和无水乙醇的质量体积比为：(1-3)g：(2-4)g：(20-40)ml。

10、进一步，所述步骤s2中n-羟基琥珀酰亚胺酯和噬菌体溶液的质量体积比为：(1-2)g：(5-15)ml。

11、进一步，所述步骤s3中羧基化纳米氧化铜和活化后的噬菌体混合液的质量体积比为：(2-3)g：(20-30)ml。

12、进一步，所述步骤s3中搅拌反应温度为5-15℃。

13、由于纳米氧化铜要在高浓度的条件下才能起到杀菌作用，但是高浓度的纳米氧化铜具有毒性，因此本发明将纳米氧化铜包裹于噬菌体中，使得纳米氧化铜可以自由的进入青枯雷尔氏菌中，引起氧化胁迫反应的发生和蛋白质变性，大大提高了纳米氧化铜的杀菌效果。

14、噬菌体表面有蛋白质组成不能直接包裹于纳米氧化铜表面，本发明用羧基化聚乙二醇对纳米氧化铜进行修饰，采用n-羟基琥珀酰亚胺酯将噬菌体表面蛋白质活化后，利用n-羟基琥珀酰亚胺酯上的亚氨基与羟基的反应，将噬菌体包裹于纳米氧化铜表面，制得具有良好抗菌效果的烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂。

15、有益效果：

16、1、本发明制备的烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂具有良好的抗菌效果，可以有效的抑制青枯雷尔氏菌的生长。

17、2、将噬菌体用n-羟基琥珀酰亚胺酯活化后包裹于羧基化聚乙二醇修饰纳米氧化铜上，成功的制的了具有良好杀菌效果的烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂。

18、说明书附图

19、图1：实施例1制得的烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的sem图；

20、图2：烟草青枯雷尔氏菌抗菌效果实验中空白对照，对照组2、对照组4和对照组1的菌落生长情况图；

21、图3：烟草青枯雷尔氏菌抗菌效果实验中空白对照，对照组2、对照组4和对照组1的青枯雷尔氏菌生长曲线图。

技术特征：

1.一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂，其特征在于，所述烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备原料包括：纳米氧化铜、羧基化聚乙二醇、无水乙醇、噬菌体、n-羟基琥珀酰亚胺酯、二甲基亚砜、氢氧化钠溶液。

2.根据权利要求1所述的一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂，其特征在于，所述纳米氧化铜的粒径为40-80nm。

3.根据权利要求1所述的一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂，其特征在于，所述噬菌体为有尾噬菌体目，短尾噬菌体科噬菌体中的一种或多种。

4.一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备方法如下：

5.根据权利要求4所述的一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中纳米氧化铜、羧基化聚乙二醇和无水乙醇的质量体积比为：(1-3)g：(2-4)g：(20-40)ml。

6.根据权利要求5所述的一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中n-羟基琥珀酰亚胺酯和噬菌体溶液的质量体积比为：(1-2)g：(5-15)ml。

7.根据权利要求6所述的一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中羧基化纳米氧化铜和活化后的噬菌体混合液的质量体积比为：(2-3)g：(20-30)ml。

8.根据权利要求7所述的一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中搅拌反应温度为5-15℃。

技术总结
本发明公开了一种烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂及其制备方法，属于抗菌剂制备领域，烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂的制备原料包括纳米氧化铜、羧基化聚乙二醇、无水乙醇、噬菌体、N‑羟基琥珀酰亚胺酯、二甲基亚砜、氢氧化钠溶液。制备步骤包括：纳米氧化铜羧基化、噬菌体活化和烟草青枯雷尔氏菌抗菌剂制备。解决了纳米氧化铜杀菌过程中难以进入病原微生物中引起氧化胁迫的发生和蛋白质变性，使得杀菌能力大幅降低，难以实现规模化应用的问题。

技术研发人员：蔡璘,张洪保,周栗禾,韦学锋,冷东蔚
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14