自发型系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及应用

本发明属于疾病动物模型构建方法，具体涉及一种系统性红斑狼疮的动物模型的构建。

背景技术：

1、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,sle)是一种复杂的自身免疫性疾病，临床表现多样，以i型干扰素(interferon,ifn)和自身抗体的过度产生为特征。sle的发病机制尚不明确，遗传易感性、环境诱因和激素水平三者相互作用，共同促进了疾病的发生发展。近年来世界范围内sle的发病率呈上升趋势，全球患病率为43.7/10万人，严重危害人类健康甚至威胁生命。开发能模拟临床症状、又兼具成本优势的动物模型，对研究sle发病机制及安全有效的新型疗法具有重要意义。

2、目前sle模型主要分为自发型和诱导型模型两种。自发型sle小鼠模型具有良好的遗传背景及遗传稳定性，包括新西兰黑(nzb)和新西兰白(nzw)小鼠杂交的f1代nzbwf1小鼠，bxsb/mpj小鼠，和mrl/lpr小鼠；人工诱导型小鼠包括淋巴细胞活性染色质诱导系统性红斑狼疮小鼠模型，空肠弯曲菌诱导的sle小鼠模型，以及降植烷诱导的sle小鼠模型等。虽然自发型小鼠模型是sle的经典模型，但此类小鼠价格偏高，发病晚，易受环境因素影响，小鼠异质性大，且小鼠基因表型和发病机制与sle患者有较大差别。人工诱导型小鼠模型价格相对较低，周期短，但其不具备遗传背景，与患者发病过程和临床表现差异较大，建模对研究者的实验操作要求较高。现有sle动物模型大多缺少典型的sle皮损改变，而与sle患者不符的基因改变及致病过程限制了它们在发病机制、病理改变、疾病治疗等方面的应用，迫切需要基于患者遗传背景的自发型sle小鼠模型，来推动sle领域的研究，加深对疾病的认识。

3、角质形成细胞、免疫细胞及免疫分子共同构成皮肤局部免疫微环境，维持组织稳态。sle患者常见皮肤受累，并且患者角质形成细胞中的炎症反应被放大。尽管尚无研究证明皮肤功能异常与sle发病存在直接联系，但皮肤型红斑狼疮可能发展成更广泛或全身性的病变，且有一定几率进展为sle；以及长期的i型ifn刺激会导致免疫细胞过度活化并诱导自身抗体的产生，这些临床现象和既往研究提示皮肤局部免疫功能异常可能促进系统性自身免疫反应并驱动sle的发生发展。

4、pparγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)是ppar通路的关键分子，能调控脂肪细胞分化和功能，调控免疫细胞的成熟和功能，影响组织和器官的细胞增殖，其信号失调还与肿瘤生成有关。目前尚未见到利用角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠构建自发型sle动物模型的报道。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，为sle的发病机制、病理特征、治疗方法研究和开发提供一种新的自发型sle动物模型。

2、为实现上述技术目的，本发明公开了一种自发型系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，包括如下步骤：

3、(1)构建角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠，所述角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠包括pparγflox/flox+/-krt5-creert2+/-和pparγflox/flox-/-krt5-creert2+/-的c57bl/6小鼠；

4、(2)使用基因敲除激活剂敲除角质形成细胞中的pparγ基因以介导疾病表型发生。

5、其中，所述基因敲除激活剂为代谢后可与雌激素受体突变体ert结合，使creert2发挥cre重组酶活性进行基因敲除的化合物。

6、在一种实施方式中，所述基因敲除激活剂为他莫昔芬或4-羟基他莫昔芬。

7、其中，他莫昔芬的使用方式为有针或无针化的腹腔注射；4-羟基他莫昔芬的使用方式为外用涂抹、皮肤贴敷、有针或无针化的皮下注射或皮内注射中的任意一种。

8、具体地，使用他莫昔芬作为基因敲除激活剂时，对角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠连续腹腔注射他莫昔芬溶液1-7天，每天一次；使用4-羟基他莫昔芬作为基因敲除激活剂时，对角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠身体部位无毛或剃毛后的皮肤连续涂抹4-羟基他莫昔芬溶液1-7天，每天一次，为了便于操作，可以选择双耳的腹侧及背侧的皮肤进行涂抹。

9、其中，所述他莫昔芬溶液按照100mg他莫昔芬、0.5ml乙醇、9.5ml玉米油的比例配置；所述4-羟基他莫昔芬溶液按照50mg 4-羟基他莫昔芬、1mldmso、9ml玉米油的比例配置；每次给小鼠注射的他莫昔芬溶液的剂量为75mg/kg(约100μl)，每次给小鼠外用涂抹的4-羟基他莫昔芬溶液的剂量为10-80μl。

10、其中，小鼠在初次腹腔注射他莫昔芬7天后或外用涂抹4-羟基他莫昔芬7天后出现疾病表型。

11、具体地，所述角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠通过如下方法构建得到：

12、将pparγflox/flox和krt5-creert2小鼠交配，得到杂交生成子一代，保留基因型为pparγflox/flox+/-krt5-creert2+/-的杂合子小鼠，将杂合子小鼠相互交配繁育得到基因型为pparγflox/flox-/-krt5-creert2+/-的小鼠。

13、本发明进一步提出了通过上述构建方法构建得到的自发型系统性红斑狼疮动物模型在研究sle疾病机理上的应用。

14、本发明还提出了通过上述构建方法构建得到的自发型系统性红斑狼疮动物模型在筛选靶向治疗狼疮皮损的药物中的应用。

15、有益效果：本发明通过敲除小鼠角质形成细胞中的pparγ，构建了一种自发型sle动物模型，其不需要人工诱导，能条件性出现系统性自身免疫性炎症，包括局部皮肤脱毛、持续性皮损、持续性蛋白尿、血清自身抗体；组织学检查有真皮免疫细胞浸润，基底膜带igg沉积，肾小球igg沉积等系统性红斑狼疮样改变，模拟了系统性红斑狼疮的临床症状，为系统性红斑狼疮的相关研究提供了重要工具，为sle的发病机制研究及药物开发提供了重要工具。该模型相较于其他狼疮鼠模型具有遗传背景而非药物诱导，发病迅速、高效稳定。在诱导角质形成细胞pparγ敲除后1-2周，构建模型的所有小鼠均会出现一定程度的表型，建模成功率为100％，组内异质性小，可重复性强。此外，krt5-creert2+/-pparγflox/flox+/-及krt5-creert2+/-pparγflox/flox-/-小鼠可通过配种繁殖持续获得，经济方便。

技术特征：

1.一种自发型系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除激活剂为代谢后可与雌激素受体突变体ert结合，使creert2发挥cre重组酶活性进行基因敲除的化合物。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除激活剂为他莫昔芬或4-羟基他莫昔芬。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，他莫昔芬的使用方式为有针或无针化的腹腔注射；4-羟基他莫昔芬的使用方式为外用涂抹、皮肤贴敷、有针或无针化的皮下注射或皮内注射中的任意一种。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，使用他莫昔芬作为基因敲除激活剂时，对角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠连续腹腔注射他莫昔芬溶液1-7天，每天一次；使用4-羟基他莫昔芬作为基因敲除激活剂时，对角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠身体部位无毛或剃毛后的皮肤双耳的腹侧及背侧的皮肤连续涂抹4-羟基他莫昔芬溶液1-7天，每天一次。

6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述他莫昔芬溶液按照100mg他莫昔芬、0.5ml乙醇、9.5ml玉米油的比例配置；所述4-羟基他莫昔芬溶液按照50mg 4-羟基他莫昔芬、1mldmso、9ml玉米油的比例配置；每次给小鼠注射的他莫昔芬溶液的剂量为75mg/kg，每次给小鼠外用涂抹的4-羟基他莫昔芬溶液的剂量为10-80μl。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，小鼠在初次腹腔注射他莫昔芬7天后或外用涂抹4-羟基他莫昔芬7天后出现疾病表型。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述角质形成细胞条件性pparγ敲除小鼠通过如下方法构建得到：

9.权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的自发型系统性红斑狼疮动物模型在研究sle疾病机理上的应用。

10.权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的自发型系统性红斑狼疮动物模型在筛选靶向治疗狼疮皮损的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种自发型系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，通过敲除角质形成细胞中的PPARγ（Peroxisome proliferator‑activated receptor gamma）使小鼠自发出现系统性红斑狼疮表型，包括局部皮肤脱毛、持续性皮损、持续性蛋白尿、血清自身抗体；组织学检查有真皮免疫细胞浸润，基底膜带IgG沉积，肾小球IgG沉积等系统性红斑狼疮样改变，模拟了系统性红斑狼疮的临床症状，为系统性红斑狼疮的相关研究提供了重要工具。

技术研发人员：陆前进,田婧汝,史丽晴
受保护的技术使用者：中国医学科学院皮肤病医院（中国医学科学院皮肤病研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14