利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法

本发明涉及植物组培，尤其涉及一种乌菜再生苗的组培方法。

背景技术：

1、乌菜(brassica campestris l.ssp.chinensis)属于不结球白菜，是十字花科芸薹属白菜亚种蔬菜，又名乌塌菜、塌塌菜、黑菜等；广泛栽培于我国江淮地区，是冬季主要蔬菜之一，有近千年的栽培历史，是调剂春节前后“冬缺”和“春淡”的理想蔬菜，在推动当地农业经济发展中起到了不可或缺的作用。因其富含维生素，又被称为‘维生素菜’。

2、随着生物技术的发展，人们愈发重视通过生物技术方法改良作物性状。植物基因工程育种作为高效改良作物性状的前沿技术，已被广泛应用。但植物基因工程依赖高效的组织培养再生体系，植物组织培养再生效率的高低直接决定遗传转化的成功与否。因此，建立高效的组织再生体系，快速获得乌菜再生苗，对利用植物基因工程改良乌菜性状等具有重要意义。

3、乌菜组织培养再生体系基本分为四大阶段：无菌苗的获得、外植体的切取与预培养、不定芽诱导、生根与驯化成苗等，涉及到不同外植体选择、不同预培养基、不同预培养时间、不同芽诱导培养基、不同生根培养基等。其中，外植体选择、预培养与芽诱导培养基对组织再生成功与否以及再生效率高低等具有较大的影响。前人研究主要以带柄子叶或下胚轴为外植体，建立了再生体系，但这套体系存在再生效率较低、周期时间较长等问题。

4、现有白菜类蔬菜组织再生方法有：袁家铮，王春明，石丽，于为常，《一种构建小白菜离体再生体系的方法》(申请号：cn201811189960)；朱丽华，《大白菜下胚轴高效离体不定芽再生的研究》(南京农业大学硕士学位论文，2005年)；陈国户,张盛云,袁凌云,朱世东,刘姗,张慧,汪承刚，2017年《乌菜高效离体子叶再生体系的建立》《分子植物育种》；张鲁刚，刘学成，茹磊，李海萍，惠麦侠，张明科，《一种大白菜真叶离体再生培养方法》(申请号201110045595.9)；张鲁刚，范爱丽，武云霞，屈会玲，惠麦侠，张明科，《一种以橙色大白菜子叶段为外植体的离体组织培养方法》(申请号200810232067.2)；刘倩倩，刘维信，《一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法》(申请号201410364506.0)。

5、上述现有技术存在以下不足：

6、1、按《一种构建小白菜离体再生体系的方法》，采用子叶为外植体，但操作较繁琐，且使用激素类型较多，不定芽诱导率较低(57.6％)，再生芽中畸形芽比例较高，未建立高效再生体系。

7、2、按《大白菜下胚轴高效离体不定芽再生的研究》，建立了大白菜下胚轴再生体系，但只对激素以及外植体相关因素进行优化，不定芽再生时间约3周时间。

8、3、按《乌菜高效离体子叶再生体系的建立》，采用子叶外植体获得了较高的再生效率，不定芽诱导率可达85.56％，但其再生时间超过4周，周期较长，且平均每外植体再生不定芽数较低(5.36)。

9、4、按《一种大白菜真叶离体再生培养方法》，利用白菜真叶进行再生；按《一种以橙色大白菜子叶段为外植体的离体组织培养方法》，以白菜子叶段为外植体进行再生；《一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法》，以白菜球叶为外植体进行离体再生；这类方法虽成功建立了组织培养再生体系，但操作繁琐、培养周期较长，工作量较大。

10、以上几种白菜类蔬菜组培方法的共性在于：外植体选择以子叶、下胚轴、真叶等为外植体，不定芽再生时间较长、部分方法体系再生率较低，短时间不能获得大量再生苗，且优化的因素不全面。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法，以克服现有技术中乌菜组培效率较低、周期较长的问题。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、提供一种利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法，该方法包括以下步骤：

4、步骤1、获取无菌种子；

5、步骤2、将步骤1所得无菌种子接种到萌发培养基上进行暗培养；

6、步骤3、取暗培养所得萌发种子，并去除种皮、根尖、两片子叶及其中间生长点，保留3～5mm大小的胚尖作为外植体；

7、步骤4、将所得外植体放入预培养基中进行低温预培养；

8、步骤5、将低温预培养后的外植体转入液体芽诱导培养基中短时振荡培养；其中，培养时长为10min，温度为室温，摇床转速为180rpm；液体芽诱导培养基成分为：ms+3％蔗糖+0.8mg/l 6-ba+0.2mg/l naa+2mg/l异戊烯基腺嘌呤，ph＝5.8；

9、步骤6、将振荡培养后的外植体转入芽诱导培养基中进行芽诱导；

10、步骤7、将步骤6所得再生植株中长出5～6片叶子的再生植株转入生根培养基中，培养至生根；

11、步骤8、将步骤7所得生根良好的植株进行炼苗后移栽至大田中。

12、进一步，所述步骤2具体为：

13、将步骤1所得无菌种子接种至萌发培养基内进行60h的暗培养，其中，萌发培养基的组成为：ms+3％蔗糖+1.0mg/l 6-ba+0.8％琼脂，ph＝5.8，暗培养培养条件为：昼夜温度为24/18℃，湿度为80％。

14、进一步，所述步骤4具体为：

15、将所得外植体放入预培养基中进行36h的低温预培养；其中，培养条件为昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000lx，湿度为80％；预培养基的组成为：ms+3％蔗糖+2mg/l 6-ba+0.4mg/l 2,4-d+0.8％琼脂，ph＝5.8。

16、进一步，所述步骤6中芽诱导培养基组成为：ms+0.8mg/l 6-ba+0.2mg/lnaa+0.8％琼脂+3％蔗糖，ph＝5.8，培养时长为20d，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000lx，湿度为80％。

17、进一步，步骤7培养时长为2周，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000lx，湿度为80％；生根培养基组成为：ms+3％蔗糖+1.0mg/liba+0.8％琼脂，ph＝5.8。

18、本发明相比现有技术具有以下优点：

19、1、本发明提供的方法，通过利用胚尖外植体可快速高效获得乌菜再生苗，显著缩短了白菜类蔬菜组织培养再生时间。

20、2、利用胚尖外植体，在芽诱导阶段之前进行短时振荡培养，可显著提高不定芽诱导效率及单个外植体不定芽数。

21、3、乌菜胚尖外植体组织再生，较子叶柄、下胚轴等外植体组织再生，有较短的再生时间、较高的再生效率，操作简单，可大量节省人力、物力。

22、4、提供了一种白菜类蔬菜新的组织再生方案，能够短时间内获得大量的再生苗，且具有更高效的再生效率，为乌菜遗传转化体系的研究奠定坚实的基础。

23、说明书附图

24、图1为实施例提供的利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法的流程图；

技术特征：

1.一种利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4具体为：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6中芽诱导培养基组成为：ms+0.8mg/l 6-ba+0.2mg/l naa+0.8％琼脂+3％蔗糖，ph＝5.8，培养时长为20d，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000lx，湿度为80％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7培养时长为2周，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000lx，湿度为80％；生根培养基组成为：ms+3％蔗糖+1.0mg/l iba+0.8％琼脂，ph＝5.8。

技术总结
本发明公开了一种利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法，涉及植物组织培养技术领域。包括将种子接种到萌发培养基上进行暗培养；培养60h后，取暗培养所得无菌萌发种子，去除种皮、根尖、两片子叶及其中间生长点，保留3～5mm大小的胚尖作为外植体；将制备的外植体放入预培养基中进行低温预培养36h；然后将预培养后的外植体转入液体芽诱导培养基中室温振荡培养10min；之后再转入芽诱导培养基中进行芽诱导20d；再之后将长出5～6片叶子的再生植株转入生根培养基中，培养至生根，时间约2周；最终将所得生根良好的植株进行炼苗并移栽移入大田中。本发明利用乌菜胚尖为外植体，结合多种培养基进行组培，有效缩短了组培时间，提高了组培效率。

技术研发人员：陈国户,尹倩,李亭,汪承刚,唐小燕,王英,刘雪晴,温宏伟,吴思文
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14