一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法

本发明涉及精子冷冻保存，尤其涉及一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法。

背景技术：

1、翘嘴鲌的收集时间主要集中在每年的11月中旬至12月底，这段时间是大湖开湖季节，亲本量大，易收集，加之气温、水温偏低，鱼类活动量小，耗氧量低，鳞片紧凑，很利于亲本的收集运输，成活率也将大大提高，供实验需求的精液基本也是在这段时间内获取，如果不能够对翘嘴鲌鱼精液进行冷冻保存，将会使得翘嘴鲌种质资源的研究进度慢，整体开发利用比例相对偏低。

2、不同种类淡水鱼的种质资源特征迥异，生存环境千差万别，导致目前我国淡水鱼种质资源高通量表型性状测定技术缺乏，性状精准鉴定与评估难度大，为此本发明提供一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，为淡水鱼的种质资源研究提供可靠的支撑条件。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，包括：以下步骤：

4、s1、精液获取

5、采集野生成熟期的翘嘴鲌鱼提取活性比较高的精液，在1-4℃的温度环境下临时保存；

6、s2、制备保存体

7、将缓释液均匀涂抹在片状薄膜的表面，涂抹厚度为1-2.5mm,并在-15℃温度环境下进行真空干冷冻，缓释液形成稳定的片状结构后将片状薄膜去除，然后在片状固态缓释液的两面均涂抹精液，精液的厚度0.25-0.5mm，形成片状保存体；

8、s3、冷冻保存

9、在2.5cm*2.5cm*2.5cm的方形保存容器中滴入1-2滴10％的乙二醇冷冻液，并将片状保存体分切成2cm*2cm的片状后投入保存容器中，在4℃温度环境下平衡20-25min后送入液氮中冷冻保存；

10、s4、解冻

11、将方形保存容器和精液从液氮中取出，置于4℃温度环境下平衡5min，增加体积比为5％复活液，然后置于20℃恒温水浴15min。

12、进一步：

13、所述制备保存体的全过程均在4℃温度环境下完成。

14、进一步：

15、所述缓释液为：含有nacl0.4％、kcl0.2％、葡萄糖1.5％质量比的溶液，且ph值为5.8。

16、进一步：

17、还包括：对获得精液进行活性检测，对成活率大于75％的精液进行冷冻保存。

18、进一步：

19、还包括：对涂抹精液的片状固态缓释液表面进行覆膜，且所使用的膜为多孔膜。

20、进一步：

21、s4中将保存容器送入液氮中冷冻保存采用两步降温保存；其中，第一步，将保存容器置于距离液氮表面5cm处平衡10分钟；第二步，将保存容器置于液氮中进行保存。

22、进一步：

23、所述复活液为：含有西洋参总皂苷2％、淫羊藿1.5％、黄芪提取物0.05％、精氨酸0.1％质量比的溶液。

24、本发明具有如下有益效果：

25、1、与现有技术相比，该一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，将缓释液冷冻形成片状固态，然后将精液均匀的涂抹在片状固态缓释液的两面，然后进行分切保存，相比较将精液与液态的缓释液搅拌均匀后分装保存，本方法能够获得较多样本，以便于实验室单独进行取出保存容器，而且本方法操作简单，使用到的设备仪器较少，便于全面的推广应用。

26、2、与现有技术相比，该一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，将精液涂抹在片状固态的缓释液中，分切之后进行在4℃温度环境下平衡20-25min，配合10％的乙二醇冷冻液，片状固态的缓释液融化，此过程不断的向精液中流入缓冲液，相对传统的混合搅拌，配比更加的均匀、可控。

技术特征：

1.一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，包括：以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：所述制备保存体的全过程均在4℃温度环境下完成。

3.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，所述缓释液为：含有nacl0.4％、kcl0.2％、葡萄糖1.5％、精氨酸0.1％质量比的溶液，且ph值为5.8。

4.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，还包括：对获得精液进行活性检测，对成活率大于75％的精液进行冷冻保存。

5.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，还包括：对涂抹精液的片状固态缓释液表面进行覆膜，且所使用的膜为多孔膜。

6.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：s4中将保存容器送入液氮中冷冻保存采用两步降温保存；其中，第一步，将保存容器置于距离液氮表面5cm处平衡10分钟；第二步，将保存容器置于液氮中进行保存。

7.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，所述复活液为：含有西洋参总皂苷2％、淫羊藿1.5％、黄芪提取物0.05％、精氨酸0.1％质量比的溶液。

技术总结
本发明涉及精子冷冻保存技术领域，尤其是指一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，包括以下步骤：S1、精液获取；S2、制备保存体、将缓释液均匀涂抹在片状薄膜的表面，涂抹厚度为1‑2.5mm,并在‑15℃温度环境下进行真空干冷冻，缓释液形成稳定的片状结构后将片状薄膜去除，然后在片状固态缓释液的两面均匀涂抹精液，精液的厚度0.25‑0.5mm，形成片状保存体；S3、冷冻保存；S4、解冻。本发明，将缓释液冷冻形成片状固态，然后将精液均匀的涂抹在片状固态缓释液的两面，然后进行分切保存，能够获得较多样本，以便于实验室单独进行取出保存容器，将精液投入实验使用。

技术研发人员：杨品红,刘良国,张运生,夏虎
受保护的技术使用者：湖南文理学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15