海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型及其构建方法和应用

本发明属于动物模型制备，具体涉及海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型及其构建方法和应用。

背景技术：

1、海鱼分枝杆菌(mycobacterium marinum,m.marinum)是一种常见的缓慢生长的非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,ntm)，主要存在于海水、淡水或水生生物体表内，最适生长温度为28～32℃，在37℃几乎不生长，常引起鱼类、两栖动物等的疾病。m.marinum是一种条件致病菌，可通过破损的皮肤或粘膜侵入人体，由皮肤感染扩散或直接接种2～8周内发病，常见于水产养殖业或湿地工作的人员，又称为“游泳池或鱼缸肉芽肿”。根据中国医学科学院2008-2017年的数据显示，皮肤分枝杆菌感染特别是ntm感染率明显升高，其中m.marinum占ntm感染的62.3％。皮肤m.marinum感染后临床表现非特异，据统计，90～95％发生在单侧上肢，皮损多表现为丘疹、结节、斑块、脓肿、溃疡，部分皮疹沿肢体淋巴管呈线状分布，少数累及深部组织，极少累及内脏器。m.marinum感染后组织病理通常表现为肉芽肿性炎症浸润，伴结核样肉芽肿或风湿病样结节。

2、实验动物模型是指使用物理、化学或生物致病因素诱导动物产生某些类似于人体疾病表现的一种模型，广泛应用于药物筛选、毒理研究、病理机制研究等。目前发现m.marinum对多种动物具有易感性，常见的动物模型包括斑马鱼、青蛙、小鼠、大鼠、蝙蝠等。斑马鱼是研究m.marinum感染最常用的动物模型，对m.marinum十分敏感，成年蛙是m.marinum的天然宿主，感染后通常会表现为无症状感染或慢性炎症。由于斑马鱼和成年蛙的免疫机制和生存环境与人类差异巨大，因此实验结果还需要在哺乳类动物中进一步验证。小鼠是实验研究中十分常用的哺乳动物，相比水生生物和两栖生物能更好地反映m.marinum在人体的感染过程。除此之外，相较于其他动物，小鼠模型具有繁殖快、易饲养、存活率高、操作简单的优点。目前已有许多小鼠感染模型应用于感染性疾病的研究，主要有小鼠尾静脉感染模型、足垫感染模型、皮肤感染模型等等。按照感染深度区分，可将目前已有的小鼠皮肤感染模型分为四类：皮下感染模型、皮内感染模型、伤口感染模型、表皮感染模型。在感染性皮肤病的研究中，人们通过构建小鼠皮肤局部感染模型观察感染过程、探究发病机制及研究疾病转归等。

3、有研究通过皮下注射法构建了小鼠皮肤感染牛分枝杆菌模型，模拟了结核分枝杆菌形成的感染性肉芽肿，用于皮肤结核的药物研究。皮下注射法适用于模拟各种侵入性感染，操作简便，易标准化，类似于人体感染m.marinum的途径。但检索国内外相关文献，发现m.marinum感染相关的小鼠模型多为静脉感染或足垫感染，尚未发现与m.marinum相关的小鼠皮肤皮下感染模型的确切研究。但临床上m.marinum感染人体后常局限于皮肤软组织，极少出现全身感染。小鼠足垫结构与人体皮肤也存在较大的差异，不能很好地反映m.marinum感染人体后的免疫过程和转归情况。因此，探索构建m.marinum感染小鼠皮肤皮下模型，为了进一步研究m.marinum感染性皮肤病的相关机制及治疗转归提供新的模型支持，具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型的构建方法。

2、本发明的第二个目的在于提供上述方法构建的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型。

3、本发明的第三个目的在于上述方法构建的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型的应用，可比较不同条件下海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠的临床特征。

4、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

5、本发明提供的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型的构建方法，基于皮肤皮下注射法构建得到，包括以下步骤：

6、(1)分离致病菌株获取海鱼分枝杆菌，平板培养得到稳定的菌落后，取少量海鱼分枝杆菌接种至新鲜的7h9肉汤培养基中，恒温摇床30℃200rpm避光培养5～7天，至对数生长期，用酶标仪测定菌液浓度，用pbs溶液稀释菌液；

7、(2)获取雄性c57bl/6j小鼠，7～8周龄，清洁级，体重20～24g，饲养3～5天，供给标准的动物饲料，自由采食饮水，让其适应环境；

8、(3)剃毛脱毛后，在小鼠背部皮肤处整理足够大的无毛发生长区域，用1ml注射器(26g/0.45×16mm)与皮肤约成15°夹角进行穿刺，针头进入皮下约0.5～1cm后缓慢挑起皮肤，避免刺穿背部肌肉，再缓慢推注100μl菌液，菌量分别为1×106cfu、1×104cfu、1×102cfu，快速拔针，用棉签轻轻按住针口避免菌液溢出；

9、(4)将感染后的小鼠分别放在18℃和25℃环境中饲养，每隔7天左右再次脱毛，充分暴露小鼠的皮肤，造模时间4周即得。

10、本发明提供了一种海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型，可通过上述海鱼分枝杆菌皮下感染模型的构建方法得到。

11、本发明还提供18℃和25℃环境温度下，不同菌量的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型的临床表现及特点。

12、本发明还提供了海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型在研究海鱼分枝杆菌感染性皮肤病的应用。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

14、(1)本发明利用皮下注射法构建了海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠皮肤模型，并在不同的环境温度、菌量下展现小鼠感染4周过程中的临床表现。

15、(2)本发明所制备的小鼠皮肤局部感染模型接近与临床患者的感染途径及感染后的表现，方法简单，成功率高，便于观察，可一次性获得足够多的模型供科研人员进行研究。

16、(3)本发明通过观察和测量小鼠的体重变化、皮损变化评估小鼠的一般情况；通过he染色、抗酸染色、免疫组化和免疫荧光染色的手段研究局部皮肤皮下感染海鱼分枝杆菌的病理特征、疾病状态、可能的致病因素等；为研究人海鱼分枝杆菌感染性皮肤疾病的作用机制及治疗研究提供理论依据。

技术特征：

1.海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型的构建方法，是基于皮肤皮下注射法构建，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，实验小鼠设有高、中、低剂量组，分别向高、中、低剂量组的实验小鼠皮下推注的菌液中海鱼分枝杆菌菌量为1×106cfu、1×104cfu、1×102cfu，注入量为100μl。

3.如权利要求1所述的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，实验小鼠采用雄性c57bl/6j小鼠，7～8周龄，清洁级，体重20～24g。

4.如权利要求1所述的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，实验小鼠分别放在18℃和25℃环境中继续饲养，每隔7天再次脱毛。

5.采用权利要求1-4任一项所述的构建方法构建得到的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型。

6.采用权利要求1-4任一项所述的构建方法构建得到的海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型在研究海鱼分枝杆菌感染性皮肤病中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，slc35e1是海鱼分枝杆菌的感染过程的影响因子。

8.slc35e1在制备治疗水生生物海鱼分枝杆菌感染的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种海鱼分枝杆菌皮下感染小鼠模型及其构建方法和应用，属于动物模型制备技术领域。该构建方法包括：选用8周大的雄性C57BL/6J小鼠，分别在18℃和25℃环境下用1×10<supgt;6</supgt;cfu、1×10<supgt;4</supgt;cfu、1×10<supgt;2</supgt;cfu的海鱼分枝杆菌在小鼠背部皮肤部位以皮下注射的方式构建皮下感染模型。通过构建的小鼠皮肤感染模型研究海鱼分枝杆菌感染性皮肤疾病，为进一步探究人皮肤感染海鱼分枝杆菌的作用机制和治疗预后提供模型支持。本发明所制备的小鼠皮肤局部感染模型接近与临床患者的感染途径及感染后的表现，方法简单，成功率高，便于观察，可一次性获得足够多的模型供科研人员进行研究。

技术研发人员：王晓华,林秀球,杨斌,蔄茂强
受保护的技术使用者：南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15