本发明涉及干细胞冻存，特别涉及一种脐带间充质干细胞的冻存方法。
背景技术：
1、间充质干细胞是来源于中胚层的一类多能干细胞，最早从骨髓中分离得到，因其易于在体外扩增，无致瘤性，在免疫调节及组织再生方面显示出强大的临床应用前景。mscs主要有两个特征：自我更新和分化潜能；同时它还可分泌一些重要的细胞因子，表达特异性受体，能够被基因修饰，从而改变其自然行为的分子易感性。因此，mscs日益受到人们的关注。许多学者先后从人脐带华通氏胶、脐带血管周围组织中通过不同方法分别分离获得类似细胞。与骨髓间充质干细胞相比，脐带具有来源广泛、采集容易，且能够变废为宝的特点。
2、虽然脐带间充质干细胞具有来源丰富、采集方便、对供者无伤害，不受伦理、法律的限制、分化能力更强、免疫原性更低等诸多有点，使得其在上述疾病的治疗方面表现出了可观的临床前景，但是在临床技术成熟前所面临的问题还有很多。因脐带间充质干细胞绝对值偏低，限制了其在临床的应用。所以如何改进培养方法、提高培养成功率特别是冷冻保存的方法是急需解决的问题。
3、目前临床使用的mscs大多就是经体外培养、低温保存后的。细胞冻存过程中导致的损伤一般是由细胞在冷冻过程中脱水、氧自由基产生和细胞凋亡酶如caspase的激活所致。caspase家族成员是凋亡级联反应的重要效应蛋白酶，抑制caspase表达能改善多种细胞冻存后的存活率。使用caspase抑制剂zvad-fmk对干细胞进行冻存，发现具有较好的冻存效果。但是目前的研究中，caspase抑制剂的种类还不够丰富，可供选择的类型还不够多，而且zvad-fmk本身对于细胞并不是完全没有活性的影响，使得研究capase抑制剂变得迫在眉睫。
技术实现思路
1、针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的冻存方法。所述方法是采用包含caspase-9单克隆抗体的冻存保护剂进行脐带间充质干细胞冻存，结果显示在该冻存保护剂下，脐带间充质干细胞的凋亡速度和凋亡数量呈现显著性下降，更有利于脐带间充质干细胞的长期冻存。
2、具体而言，本发明首先提供了一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3、1)分离得到的脐带间充质干细胞；
4、2)配置包含caspase-9单克隆抗体的冻存保护剂；
5、3)将步骤1)中分离的得到的脐带间充质干细胞溶解于步骤2)配置的冻存保护剂，轻轻的摇晃混匀；将冻存管依次置于4℃30min、-20℃2h、-80℃12h，并最后放置于液氮中进行冷冻保存。
6、优选地，步骤1)中包括如下步骤：
7、a)在无菌条件下，取新鲜脐带，使用无菌含双抗(50-100u/ml青霉素+50-100u/ml链霉素)的pbs充分洗涤，切成2～3cm小段之后，剥去脐动脉和脐静脉，剥离外膜，只留血管周围的华通胶物质，用锋利的剪刀剪成小块；
8、b)使用0.1-0.2％的透明质酸酶和0.2-0.5％的膜蛋白酶依次消化，37℃10-30分钟；
9、c)向消化液中加入等体积0.01-0.02％乙二胺四乙酸磷酸盐溶液，37℃摇床振荡10-20分钟；
10、d)振荡结束后，采用100-200目滤网过滤，收集滤过液，将收集的滤过液以1000g离心5-10分钟，弃去上清液，用低糖dmem培养基清洗2-3次，即获得脐带间充质干细胞；
11、优选地，步骤2)中所述caspase-9单克隆抗体的重链可变区序列如seq idno:2所示，轻链可变区序列如seq id no:3所示；
12、进一步优选地，所述caspase-9单克隆抗体的重链可变区包括cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，所述cdr-h1-3的序列如seq id no.4-6所示，轻链可变区包括cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3，所述cdr-l1-3的序列如seq id no.7-9所示；
13、优选地，步骤2)的配置方法为依次称取10-20％caspase-9单克隆抗体、10-20％海藻糖、1-5％羧甲基纤维素钠溶液、10-15％二甲基亚砜，并采用低糖dmem培养基清溶解混匀，即可得到冻存保护剂。
14、优选地，步骤3)中细胞与冻存保护剂的体积比为1:5-10；
15、另一方面，本发明还提供了所述冻存保护剂在制备脐带间充质干细胞冻干粉中的用途。
16、另一方面，本发明还提供了一种caspase-9单克隆抗体，其特征在于重链可变区序列如seq id no:2所示，轻链可变区序列如seq id no:3所示。
17、优选地，本发明还提供了所述caspase-9单克隆抗体在制备脐带间充质干细胞冻存保护剂中的用途。
18、本发明的优点如下：1)本发明首次提供了针对caspase-9的单克隆抗体，该抗体具备良好的结合活性和特异性，能有效抑制细胞中的caspase-9蛋白的活性，抑制细胞凋亡，延长细胞的冻存周期。经实验验证，以含有caspase-9单克隆抗体的冻存保护剂可以有效提升脐带间充质干细胞的冻存复苏活率，减少因冻存过程中因为环境变化而激发的凋亡刺激，延长细胞的冻存时间。
19、2)尤其是，经过长期的冻存试验后，本发明的脐带间充质干细胞仍具备超高的冻存复苏率，脐带间充质干细胞的凋亡速度和凋亡数量呈现显著性下降，更有利于脐带间充质干细胞的长期冻存。
1.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含双抗是由50-100u/ml青霉素和50-100u/ml链霉素组成。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述caspase-9单克隆抗体的重链可变区包括cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，所述cdr-h1-3的序列如seq id no.4-6所示，轻链可变区包括cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3，所述cdr-l1-3的序列如seq id no.7-9所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述caspase-9单克隆抗体的重链可变区序列如seq id no:2所示，轻链可变区序列如seq id no:3所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)的配置方法为依次称取10-20％caspase-9单克隆抗体、10-20％海藻糖、1-5％羧甲基纤维素钠溶液、10-15％二甲基亚砜，并采用低糖dmem培养基清溶解混匀，即可得到冻存保护剂。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中细胞与冻存保护剂的体积比为1:5-10。
8.一种caspase-9单克隆抗体，其特征在于，所述caspase-9单克隆抗体的重链可变区包括cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，所述cdr-h1-3的序列如seq id no.4-6所示，轻链可变区包括cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3，所述cdr-l1-3的序列如seq id no.7-9所示。
9.一种caspase-9单克隆抗体，其特征在于，所述caspase-9单克隆抗体的重链可变区序列如seq id no:2所示，轻链可变区序列如seq id no:3所示。
10.权利要求8-9任一项所述caspase-9单克隆抗体在制备脐带间充质干细胞冻存保护剂中的用途。