一种增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法

本发明属于植物组织培养，更具体地说，涉及一种增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法。

背景技术：

1、湿地松(pinus elliottii)原产于美国东南部地区，自上世纪三十年代引种我国以来，因其生长迅速、产脂量高及适应性强等特点，迅速发展成为我国南方地区重要的造林树种，尤其是江西省，现已成为全国湿地松造林面积最大的省份，拥有湿地松林面积近60万公顷，占全省人工林面积的17.65％，是江西省重要的材用、脂用和生态树种。多年来科研工作者围绕湿地松材性和松脂等形状的遗传改良研究一直在持续，但传统育种方法周期长，制约了湿地松相关产业发展，如何缩短湿地松育种周期就变的十分迫切。

2、无性系林业是世界林业发展的一个趋势，将选育出林木优良无性系经过无性繁殖进行扩繁，短时间内繁育大量性状统一的优良苗木用于人工林经营，可以缩短湿地松良种推广进程，提高生态和经济效益。目前湿地松无性繁殖技术的研究有扦插、嫁接、常规组织培养等方法，但成本高，效率低，难以达到生产要求。植物体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis)具有稳定性好、繁殖系数高、同步化水平高等优点，在规模化无性繁殖、人工种子制备、种质保存及遗传转化体系构建等领域具有重要的应用价值，是当前国内外进行无性繁殖技术研究的主要手段。

3、在湿地松体胚发生技术中，胚性愈伤组织的增殖是体胚生产体系中关键一步，其增殖效率高低及胚性保持对体胚繁殖至关重要。然而，在湿地松体胚增殖过程中，随着继代次数的增多，细胞胚性逐渐降低，细胞出现退化现象，影响胚性愈伤组织的利用。因此，如何恢复和增强细胞胚性，进而增加利用效率是体胚科研和生产应用中的关键。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，从而建立湿地松的高效再生方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，将胚性退化的湿地松胚性愈伤组织接种到增殖培养基中进行增殖培养，获得胚性增强的湿地松胚性愈伤组织；所述增殖培养基为mlp基础培养基，还添加6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0-0.3mg/l或psk 0-5mg/l。

4、所述mlp基础培养基配方为：kno3 909.9mg/l、ca(no3)2·4h2o 236.2mg/l、nh4no3200.0mg/l、kh2po4 136.1mg/l、mgso4·7h2o 246.5mg/l、mg(no3)2·6h2o256.5mg/l、mgcl2·6h2o 101.7mg/l、h3bo3 15.5mg/l、znso4·7h2o 14.668mg/l、mnso4·h2o 10.5mg/l、na2moo4·2h2o 0.125mg/l、ki 4.15mg/l、cuso4·5h2o0.1725mg/l、cocl2·6h2o 0.125mg/l、feso4·7h2o 13.93mg/l、edta-na218.65mg/l、glycine 2.0mg/l、nicotinic acid0.5mg/l、thiamine hcl 1.0mg/l、tocopherol 0.5mg/l。

5、所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0-0.3mg/l或psk 0-5mg/l。

6、所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0.1mg/l。

7、所述增殖培养基的ph为5.8。

8、所述增殖培养的培养条件为温度22±1℃，湿度60％-65％，暗培养。

9、增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，具体步骤为：

10、将继代20次的湿地松胚性细胞或继代12次的湿地松胚性细胞接种到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基的ph为5.8，诱导培养的条件为培养温度22±1℃，湿度60％-65％，暗培养；所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0-0.3mg/l或psk 0-5mg/l。

11、所述湿地松胚性细胞为继代20次的湿地松胚性细胞，所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0.1mg/l或psk 0.5mg/l。

12、所述湿地松胚性细胞为继代12次的湿地松胚性细胞，所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0.1mg/l或psk 1.0mg/l。

13、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

14、本发明的增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，将胚性退化的湿地松胚性愈伤组织接种到增殖培养基中进行增殖培养，获得胚性增强的湿地松愈伤组织。增殖培养基配方优选为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0.1mg/l。结果表明，iba浓度为0.10mg/l时，愈伤组织胚性的恢复效果最佳。

技术特征：

1.一种增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，将胚性退化的湿地松胚性愈伤组织接种到增殖培养基中进行增殖培养，获得胚性增强的湿地松胚性愈伤组织；所述增殖培养基为mlp基础培养基，还添加6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0-0.3mg/l或psk 0-5mg/l。

2.根据权利要求1所述增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，所述mlp基础培养基配方为：kno3 909.9mg/l、ca(no3)2·4h2o236.2mg/l、nh4no3 200.0mg/l、kh2po4 136.1mg/l、mgso4·7h2o 246.5mg/l、mg(no3)2·6h2o 256.5mg/l、mgcl2·6h2o101.7mg/l、h3bo3 15.5mg/l、znso4·7h2o14.668mg/l、mnso4·h2o 10.5mg/l、na2moo4·2h2o0.125mg/l、ki 4.15mg/l、cuso4·5h2o 0.1725mg/l、cocl2·6h2o 0.125mg/l、feso4·7h2o13.93mg/l、edta-na2 18.65mg/l、glycine 2.0mg/l、nicotinic acid 0.5mg/l、thiaminehcl1.0mg/l、tocopherol 0.5mg/l。

3.根据权利要求1所述增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0-0.3mg/l或psk 0-5mg/l。

4.根据权利要求3所述增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0.1mg/l。

5.根据权利要求3所述增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，所述增殖培养基的ph为5.8。

6.根据权利要求1所述增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，所述增殖培养的培养条件为温度22±1℃，湿度60％-65％，暗培养。

7.根据权利要求1任一所述增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，具体步骤为：

8.根据权利要求7所述增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，所述湿地松胚性细胞为继代20次的湿地松胚性细胞，所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0.1mg/l或psk 0.5mg/l。

9.根据权利要求7所述增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，其特征在于，所述湿地松胚性细胞为继代12次的湿地松胚性细胞，所述增殖培养基配方为mlp基础培养基、蔗糖30g/l、结冷胶4.0g/l、6-ba 0.5-1.0mg/l、kt 0.5-1.0mg/l、naa 1.0-2.0mg/l、l-谷氨酰胺450mg/l、水解酪蛋白500mg/l、肌醇500mg/l、2-(n-吗啉)乙磺酸一水物250mg/l、iba 0.1mg/l或psk 1.0mg/l。

技术总结
本发明公开了一种增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，属于植物组织培养领域。本发明的增强胚性退化的湿地松胚性愈伤组织胚性的方法，将胚性退化的湿地松胚性愈伤组织接种到增殖培养基中进行增殖培养，获得胚性增强的湿地松愈伤组织。增殖培养基配方优选为mLP基础培养基、蔗糖30g/L、结冷胶4.0g/L、6‑BA 0.5‑1.0mg/L、KT 0.5‑1.0mg/L、NAA 1.0‑2.0mg/L、L‑谷氨酰胺450mg/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇500mg/L、2‑(N‑吗啉)乙磺酸一水物250mg/L、IBA 0.10mg/L。IBA浓度为0.10mg/L时，愈伤组织胚性的恢复效果最佳。

技术研发人员：杨春霞,邓诏磊,胡珊,刘倩,丁伟,周光,谷振军,杜强
受保护的技术使用者：江西省林业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16