一种斑马鱼模型及其建立方法和应用

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种斑马鱼模型及其建立方法和应用。

背景技术：

1、病毒性感染疾病的特点是传染性强、传播速度快及后果严重。除疫苗外，抗病毒药物在治疗病毒性感染疾病中也发挥着重要作用。由于病毒的特性，对抗病毒药物的筛选实验需要在高等级生物安全实验室(生物安全3级或4级实验室)中进行。因此在大范围筛选抗病毒药物方面仍然存在较多不便，因此安全且可靠的抗病毒药物筛选方法的研发至关重要。其中一种方法就是建立动物模型，通过给药动物模型，来评价药物的药效，从而对抗病毒药物进行筛选，然而常用的小鼠模型，建模花费较多，且较难兼顾既呈现与人类相似的病毒感染后的炎症状态，又能便于观察。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种斑马鱼模型的建立方法，该方法能够得到稳定的斑马鱼模型，该模型能够模拟与人类相似的受到病毒感染后的炎症状态，可用于评估抗病毒药物是否对病毒起到抑制作用，以及不同抗病毒药物的药效差异，从而对抗病毒药物进行初步筛选。

2、为了达到上述目的，本发明提供一种斑马鱼模型的建立方法，包括以下步骤：采用聚肌胞苷酸注射斑马鱼，复苏，培养。

3、本发明人在研究过程中发现，动物模型常用的小鼠，但小鼠模型造模周期长，通常需要预给药7天以上，不仅花费较高，且不便于大批量筛选药物，不适合用于高通量筛选，因此，小鼠模型不能稳定、有效地用于抗病毒药物的筛选。而斑马鱼(danio rerio)是一种小型热带淡水鱼，原产于印度半岛，作为新兴的模式动物，拥有与人类基因组较高同源性的基因组，且具有相似的炎症细胞和受体，能够较好的模拟人类受病毒感染后的炎症状态，使建立得到的斑马鱼模型能够较好地体现抗病毒药物的药效，从而实现评估抗病毒药物是否对病毒起到抑制作用，以及不同抗病毒药物的药效差异。同时，斑马鱼具有产卵周期短且产卵量大、胚胎透明、体外受精发育等优点，因此，采用其作为建模基础，实验周期更短、实验花费更少，适合高通量筛选，可以同时比较多种药物之间的药效差异。

4、在选择斑马鱼作为建模基础的前提下，本发明人采用聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，polyic)进行注射来建立斑马鱼模型，因为聚肌胞苷酸作为一种人工合成的双链病毒rna模拟物，是病毒常见的复制中间体，可以被toll样受体3(toll-likereceptor 3，tlr3)识别并激活，参与调节机体免疫功能、细胞凋亡等病理过程，诱导机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应，因此，注射聚肌胞苷酸能够使斑马鱼模型较好地模拟人类受病毒感染后的炎症状态。

5、在其中一个实施例中，所述注射为显微注射，所述注射的位置为斑马鱼的卵黄囊。

6、在其中一个实施例中，所述聚肌胞苷酸的浓度为0.8-1.2mg/ml，所述聚肌胞苷酸的用量为1.5-2.5nl。

7、因斑马鱼，特别是受精后3天的幼鱼，生命力较为脆弱，故需要严格控制聚肌胞苷酸的浓度和用量，否则容易出现斑马鱼死亡或者卵黄囊破裂致死的现象。

8、在其中一个实施例中，所述复苏采用胚胎培养液实现，所述复苏的温度为27-29℃，所述培养的时间为10-14h。

9、在其中一个实施例中，所述建立方法还包括：采用聚肌胞苷酸注射斑马鱼前，将斑马鱼麻醉；所述麻醉的麻醉剂包括三卡因。

10、本发明还提供了所述建立方法得到的斑马鱼模型。

11、上述斑马鱼模型比较稳定，能够模拟与人类相似的受到病毒感染后的炎症状态，可用于评估抗病毒药物是否对病毒起到抑制作用，以及不同抗病毒药物的药效差异，从而对抗病毒药物进行初步筛选。

12、本发明还提供了一种抗病毒药物的评估方法，包括：权利要求6所述的斑马鱼模型复苏后，浸泡待测药物，培养，进行组织染色检测、中性粒细胞检测、炎症因子检测和/或生存率分析检测，根据检测结果评估待测药物的药效。

13、在其中一个实施例中，所述抗病毒药物的评估方法中的培养的时间为10-14h。

14、在其中一个实施例中，所述检测结果包括中性粒细胞迁移聚集增加，所述中性粒细胞的数量低，所述炎症因子的表达量低和/或所述生存率高，则提示待测药物的药效高。

15、在其中一个实施例中，所述炎症因子包括tnf-α和/或il-6。

16、本发明还提供了所述斑马鱼模型在抗病毒药物的评估中的应用。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、本发明的一种斑马鱼模型的建立方法，该方法能够得到稳定的斑马鱼模型，该模型能够模拟与人类相似的受到病毒感染后的炎症状态，可用于评估抗病毒药物是否对病毒起到抑制作用，以及不同抗病毒药物的药效差异，从而对抗病毒药物进行初步筛选。

技术特征：

1.一种斑马鱼模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：采用聚肌胞苷酸注射斑马鱼，复苏，培养。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述注射为显微注射，所述注射的位置为斑马鱼的卵黄囊。

3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述聚肌胞苷酸的浓度为0.8-1.2mg/ml，所述聚肌胞苷酸的用量为1.5-2.5nl。

4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述复苏采用胚胎培养液实现，所述复苏的温度为27-29℃，所述培养的时间为10-14h。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述建立方法还包括：采用聚肌胞苷酸注射斑马鱼前，将斑马鱼麻醉；所述麻醉的麻醉剂包括三卡因。

6.权利要求1-5中任一项所述建立方法得到的斑马鱼模型。

7.一种抗病毒药物的评估方法，其特征在于，包括：权利要求6所述的斑马鱼模型复苏后，浸泡待测药物，培养，进行组织染色检测、中性粒细胞检测、炎症因子检测和/或生存率分析检测，根据检测结果评估待测药物的药效。

8.根据权利要求7所述的评估方法，其特征在于，所述检测结果包括中性粒细胞迁移聚集增加，所述中性粒细胞的数量低，所述炎症因子的表达量低和/或所述生存率高，则提示待测药物的药效高。

9.根据权利要求7所述的评估方法，其特征在于，所述炎症因子包括tnf-α和/或il-6。

10.权利要求6所述的斑马鱼模型在抗病毒药物的评估中的应用。

技术总结
本发明涉及一种斑马鱼模型及其建立方法和应用，涉及生物医药领域。该建立方法包括以下步骤：采用聚肌胞苷酸注射斑马鱼，复苏，培养。该方法能够得到稳定的斑马鱼模型，该模型能够模拟与人类相似的受到病毒感染后的炎症状态，可用于评估抗病毒药物是否对病毒起到抑制作用，以及不同抗病毒药物的药效差异，从而对抗病毒药物进行初步筛选。

技术研发人员：刘俊珊,郭新邓,区锦莹,邹丽芳,卢子滨,曹惠慧,郭卓琳
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15