一种茶树体细胞胚胎直接发生方法

本发明涉及植物无性繁殖，具体涉及一种茶树体细胞胚胎直接发生方法。

背景技术：

1、茶树(camellia sinensis(l.)o.kuntze)是一种重要的叶用型经济作物，具有悠久的栽培历史，茶叶中所富含的氨基酸和儿茶素等物质具有独特的抗氧化活性，对预防动脉粥样硬化和心血管疾病等多种疾病具有重要的价值。目前茶树的主要育种方式为种子繁殖和短穗扦插，但这两种栽培方式均存在繁殖系数低、育种周期长等问题。(mukhopadhyaym,mondal tk,chand pk(2016)biotechnological advances in tea(camellia sinensis[l.]o.kuntze):a review.plant cell rep 35(2):255-287.doi:10.1007/s00299-015-1884-8)。基于组织培养的体细胞胚胎发生技术能有效克服传统茶树育种存在的困难。体细胞胚胎发生是单倍体或二倍体体细胞经历类似于合子胚的组织分化并最终发育成完整植株的过程(williams eg,maheswaran g(1986)somatic embryogenesis:factorsinfluencing coordinated behaviour of cells as an embryogenic group..ann bot57(4):443-462.doi:10.1093/oxfordjournals.aob.a087127)。但目前关于茶树体细胞胚胎发生的研究有限，并且体胚发生效率有待提高，实用性不强，尚不能推广使用。

2、由此可知，目前仍没有建立高效的体细胞胚胎发生体系，茶树诱变育种、新品种培育等受到限制，因此有必要建立高效体细胞胚胎直接发生方法，已达到缩短育种周期、定向改良性状的目的。

3、鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决目前没有建立高效的体细胞胚胎发生体系，茶树诱变育种、新品种培育等受到限制的问题，提供了一种茶树体细胞胚胎直接发生方法。

2、为了实现上述目的，本发明公开了一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，包括以下步骤：

3、s1，外植体材料的制备：取茶树未成熟茶籽，消毒清洗后用钳子和镊子剥去茶籽黑色外壳，去除茶籽生长点保留未成熟子叶，以未成熟子叶作为外植体；

4、s2，体细胞胚胎起始：将步骤s1中切好的未成熟茶籽，接种于体胚诱导培养基中，光照培养30-35天；

5、s3，体细胞胚胎成熟：将步骤s2中获得的球形胚接种于体胚成熟培养基中，光照培养45～50天；

6、s4，体细胞胚胎萌发和生根：将步骤s3中获得的子叶型胚接种于体胚萌发和生根培养基中，光照培养55～60天。

7、所述步骤s1中茶树未成熟茶籽先用75％乙醇消毒30s，再用50％ h2o2处理40min，最后用无菌水冲洗4～5次。

8、所述步骤s2中体胚诱导培养基的配方以wpm作为基础培养基，添加0.25～1mg/lnaa、0.25～1mg/l 2,4-d和0.25～0.5mg/l 6-ba。

9、所述naa添加量为1mg/l，6-ba添加量为0.5mg/l。

10、所述步骤s3中体胚成熟培养基的配方以wpm作为基础培养基，添加30～120g/l蔗糖、0.5～2mg/l aba、2g/l活性炭。

11、所述蔗糖添加量为90g/l，aba添加量为2mg/l。

12、所述步骤s4中体胚萌发和生根培养基的配方以ms作为基础培养基，添加0.05～0.2mg/l naa和1～4mg/l 6-ba

13、所述naa添加量为1mg/l，6-ba的添加量为0.1mg/l。

14、所述体胚诱导培养基、体胚诱导培养基、体胚萌发和生根培养基中还添加有植物凝胶，所述植物凝胶的添加量为3g/l，所述体胚诱导培养基、体胚诱导培养基、体胚萌发和生根培养基的ph调节至5.8。

15、所述步骤s2～s4中光照培养的条件为23～26℃，光照16h/d。

16、与现有技术比较本发明的有益效果在于：

17、1、本发明的茶树体细胞胚胎直接发生方法中体细胞胚胎诱导率最高可达25.22±1.73％，最高的子叶胚诱导率为(12.62±1.57％)；

18、2、本发明的再生芽环节需8周，四个星期后，再生的幼苗进一步伸长，当根长达到3-5厘米后，将幼苗驯化并将转化到土壤中，体细胞胚胎的最高发芽率为(20.2±0.1％)，1mg/l naa与0.5mg/l 6-ba组合的处理比其他处理表现出更高的体细胞胚胎诱导率，表明6-ba与naa一起使用对表现出更高的效率，naa和6-ba的组合促进了未成熟子叶的球状胚的形成，添加活性碳最有利于体细胞胚胎的成熟，子叶胚在含有0.1mg/l naa和1mg/l 6-ba的ms培养基上萌发形成完整的植株；

19、3、本发明建立以未成熟茶籽为起始外植体材料，培养条件配合合理的激素配方，诱导茶籽产生体细胞胚胎。通过本发明的方法，能够在短时间内产生大量的茶树优质苗。对开展茶树遗传改良、新品种培育等研究具有深远影响。

技术特征：

1.一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述步骤s1中茶树未成熟茶籽先用75％乙醇消毒30s，再用50％h2o2处理40min，最后用无菌水冲洗4～5次。

3.如权利要求1所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述步骤s2中体胚诱导培养基的配方以wpm作为基础培养基，添加0.25～1mg/l naa、0.25～1mg/l 2,4-d和0.25～0.5mg/l 6-ba。

4.如权利要求3所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述naa添加量为1mg/l，6-ba添加量为0.5mg/l。

5.如权利要求1所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述步骤s3中体胚成熟培养基的配方以wpm作为基础培养基，添加30～120g/l蔗糖、0.5～2mg/l aba、2g/l活性炭。

6.如权利要求1所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述蔗糖添加量为90g/l，aba添加量为2mg/l。

7.如权利要求1所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述步骤s4中体胚萌发和生根培养基的配方以ms作为基础培养基，添加0.05～0.2mg/l naa和1～4mg/l6-ba。

8.如权利要求7所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述naa添加量为1mg/l，6-ba的添加量为0.1mg/l。

9.如权利要求1所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述体胚诱导培养基、体胚诱导培养基、体胚萌发和生根培养基中还添加有植物凝胶，所述植物凝胶的添加量为3g/l，所述体胚诱导培养基、体胚诱导培养基、体胚萌发和生根培养基的ph调节至5.8。

10.如权利要求1所述的一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，其特征在于，所述步骤s2～s4中光照培养的条件为23～26℃，光照16h/d。

技术总结
本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体涉及一种茶树体细胞胚胎直接发生方法，以茶树未成熟子叶作为外植体，接种于体胚诱导培养基上获得球形体胚，再经体胚成熟和体胚萌发步骤获得体胚苗。体细胞胚胎起始受茶品种、外植体年龄和植物生长调节剂的影响：本发明的优点是，建立了一个高效的直接体细胞胚胎系统，包括体细胞胚胎的起始、成熟和萌发。此方法的建立可以克服茶树繁殖系数低和育种周期长等问题，为茶树优质品种的选育和遗传转化体系的建立奠定基础。

技术研发人员：张照亮,聂鑫茹,王静娴,张天择,任露露,黄克林,杨天元,韦朝领,朱木兰,李曼
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15