一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺的制作方法

本发明涉及细胞冻存液，具体涉及一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺。

背景技术：

1、细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，通常需要使用冻存液对细胞进行冻存，常见的冻存液会加入二甲基亚砜dmso，然而dmso有一定的细胞毒性，可能造成细胞结构和功能的不可逆损伤，影响干细胞的存活率，导致临床患者细胞移植后出现不良反应。

2、目前，干细胞冻存液会使用到羟乙基淀粉和海藻糖等非渗透型组分，有良好的抗冻性能和抑制渗透损伤的能力，能够在低温条件下稳定细胞膜结构，但是非渗透型组分难以进入细胞内，保存细胞的效果有限，因此，亟需开发一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺，通过使用非渗透型组分和天然渗透型组分复配，使干细胞维持与新鲜细胞相似的形态和活力，从而满足临床治疗用细胞的冻存要求。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺。

2、一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，具体包括以下步骤：

3、s1：制备细胞外冻存保护剂

4、将羟乙基淀粉加入无血清培养基中，通过无菌滤膜对羟乙基淀粉溶液进行过滤除菌，得到细胞外冻存保护剂；

5、s2：制备细胞内冻存保护剂

6、将脯氨酸加入无血清培养基中，得到浓度为20％～22％的脯氨酸溶液，通过0.20-0.22μm无菌滤膜对脯氨酸溶液进行过滤除菌，得到细胞内冻存保护剂；

7、s3：制备稳定剂

8、将甲基纤维素加入消毒容器中，通过加热装置加热，通过紫外线灯进行灭菌消毒，甲基纤维素通过无菌管道进入搅拌容器中，通过冰水浴使搅拌容器内的甲基纤维素冷却，加入无血清培养基后，通过搅拌器将甲基纤维素搅拌均匀，将搅拌容器放入冷冻装置内保存，通过水浴装置使甲基纤维素溶液融化，得到稳定剂，通过无菌分装设备将稳定剂装入分装容器中，通过冷冻装置对分装好的稳定剂进行储存；

9、s4：制备pbs缓冲液

10、通过电子秤称取nacl、kh2p04和na2hp04·12h20至定量容器中，再加入蒸馏水至定量容器中，定容得到pbs缓冲液，将配制好的pbs缓冲液加入高压灭菌容器中进行高压灭菌，将灭菌后的pbs缓冲液装入保温容器中保存；

11、s5：无菌混合灌装

12、将分装好的稳定剂在2℃-4℃的条件下融化，再将细胞外冻存保护剂、细胞内冻存保护剂、稳定剂和pbs缓冲液按体积比为(5-6)：(2-3)：(1-2)：(2-3)进行无菌混合灌装，得到冻存液，羟乙基淀粉最终浓度为5％-7％，脯氨酸最终浓度为4％～4.4％，甲基纤维素最终浓度为1％-1.2％。

13、进一步地，步骤s1制备细胞外冻存保护剂，具体包括以下步骤：

14、s1.1：将羟乙基淀粉加入无血清培养基中，得到浓度为10％～14％的羟乙基淀粉溶液；

15、s1.2：通过0.20-0.22μm无菌滤膜对羟乙基淀粉溶液进行过滤除菌，得到细胞外冻存保护剂。

16、进一步地，步骤s3制备稳定剂，具体包括以下步骤：

17、s3.1：将甲基纤维素加入消毒容器中，通过加热装置对甲基纤维素进行加热，通过紫外线灯对甲基纤维素进行灭菌消毒；

18、s3.2：灭菌后的甲基纤维素通过无菌管道进入搅拌容器中，通过冰水浴使搅拌容器内的甲基纤维素冷却至37℃-38℃，加入无血清培养基后，甲基纤维素的浓度为5％-6％，通过搅拌器将甲基纤维素搅拌均匀，将装有甲基纤维素的搅拌容器放入冷冻装置内，在-22℃～-20℃的条件下放置12h-14h；

19、s3.3：将搅拌容器放在水浴装置中，使甲基纤维素和培养基在2℃-4℃的条件下融化，得到稳定剂；

20、s3.4：通过无菌分装设备将稳定剂装入分装容器中，通过冷冻装置使分装好的稳定剂在-22℃～-20℃条件下储存。

21、进一步地，步骤s4制备pbs缓冲溶液，具体包括以下步骤：

22、s4.1：通过电子秤称取nacl、kh2p04和na2hp04·12h20至定量容器中，再加入蒸馏水至定量容器中，定容得到pbs缓冲液，pbs缓冲液中nacl、kh2p04和na2hp04·12h20的质量比例为(8.9-9)：(0.14-0.15)：(2-2.1)；

23、s4.2：将配制好的pbs缓冲液加入高压灭菌容器中，对pbs溶液进行高压灭菌，灭菌温度为121℃-122℃，计时器计时，高压灭菌15-20min后，在4℃-6℃条件下将灭菌后的pbs缓冲液装入保温容器中保存。

24、进一步地，在进行步骤s3.3通过水浴装置将搅拌容器的温度保持在2℃-4℃时，此时可以同步进行步骤s4.2，将步骤s4.2中的pbs缓冲液和步骤s3.3中的搅拌容器分别置于两个连通的水浴箱中，并使步骤s4.2中的pbs缓冲液先接触到冷水，待冷水从pbs缓冲液所在的水浴箱中离开后，则通过保温管道进入步骤s3.3的搅拌容器，最后回到制冷装置中。

25、进一步地，无菌滤膜具体为醋酸纤维滤膜。

26、一种提高干细胞存活率的冻存液，应用一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺制备得到。

27、有益效果是：1、本发明通过制备细胞外冻存保护剂和细胞内冻存保护剂，使用非渗透型组分和天然渗透型组分复配，羟乙基淀粉能够减弱渗透损伤，提高细胞在高渗环境中的存活率，脯氨酸生物相容性好，有调节细胞内外渗透压平衡和抑制氧化损伤的作用，制备的冻存液不含dmso和血清，减少细胞毒性，从而提高干细胞存活率。

28、2、本发明通过加入甲基纤维素，甲基纤维素对细胞有调节粘度的作用，能耐酸碱、微生物和耐热，用于减少细胞冻存和附属过程中渗透压变化引起的损伤，甲基纤维素的水溶液非常稳定，利于冻存液的长期储存。

29、3、本发明通过将pbs缓冲液和搅拌容器分别置于两个连通的水浴箱中，使得pbs缓冲液和搅拌容器能够同时在水浴装置中进行水浴，从而利用高压灭菌过程中产生的热量，使热量传递至装有甲基纤维素溶液的搅拌容器中，节能环保。

技术特征：

1.一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，所述步骤s1制备细胞外冻存保护剂，具体包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，所述步骤s3制备稳定剂，具体包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，所述步骤s4制备pbs缓冲溶液，具体包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，在进行步骤s3.3通过水浴装置将搅拌容器的温度保持在2℃-4℃时，此时可以同步进行步骤s4.2，将步骤s4.2中的pbs缓冲液和步骤s3.3中的搅拌容器分别置于两个连通的水浴箱中，并使步骤s4.2中的pbs缓冲液先接触到冷水，待冷水从pbs缓冲液所在的水浴箱中离开后，则通过保温管道进入步骤s3.3的搅拌容器，最后回到制冷装置中。

6.根据权利要求2所述的一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，无菌滤膜具体为醋酸纤维滤膜。

7.一种提高干细胞存活率的冻存液，由权利要求1-6任一项所述的一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺制备得到。

技术总结
本发明涉及细胞冻存液技术领域，具体涉及一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺。本发明提供了这样一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺，包括以下步骤：制备细胞外冻存保护剂，制备细胞内冻存保护剂，制备稳定剂，制备PBS缓冲液和无菌混合灌装。本发明通过制备细胞外冻存保护剂和细胞内冻存保护剂，使用非渗透型组分和天然渗透型组分复配，羟乙基淀粉能够减弱渗透损伤，提高细胞在高渗环境中的存活率，脯氨酸生物相容性好，有调节细胞内外渗透压平衡和抑制氧化损伤的作用，制备的冻存液不含DMSO和血清，减少细胞毒性，从而提高干细胞存活率。

技术研发人员：韩之海,王家伦,张磊升,曹俊宇,程翀,余桃英
受保护的技术使用者：江西汉氏联合干细胞科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16