无血清细胞冻存液及其应用

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种无血清细胞冻存液及其应用。

背景技术：

1、类器官是将成体干细胞或多功能干细胞进行体外三维培养而形成的多细胞复合体，其具有自我更新和自我组织能力，与来源组织器官具有高度相似的组织学特性和遗传学背景，并能保持组织器官的部分生理功能。类器官可以在体外长期扩增、冻存复苏，可以建立活的、可以随时调取、复苏的类器官样本库。类器官无论从基因突变谱、蛋白表达差异、以及异质性上都与体内组织非常相似。因此，类器官在疾病致病机制研究、新药研发、精准医疗、再生医学等领域显示出巨大的应用前景。

2、类器官冻存是类器官库建立和类器官技术应用的重要环节。细胞冻存过程中需要添加dmso、甘油等保护剂，以减少冻存过程中渗透压改变、脱水、ph值改变、冰晶形成等对细胞造成的损伤。而由原代细胞或多功能干细胞培养而来的类器官作为直径为几十到几百微米的三维细胞复合物，在冻存过程中不仅要维持细胞活性，还要维持类器官的结构。目前常用的细胞冻存液通常含有二甲基亚砜(dmso)、血清、细胞培养基等。血清成分复杂，含有多种可能影响细胞干性的生长因子或小分子物质，可能会导致冻存复苏后的原代细胞和类器官活性丧失，影响复苏后细胞和类器官的培养成功率。因此，迫切需要开发一种能较好的维持原代细胞和类器官活性的冻存液，以提高细胞和类器官冻存复苏效率，为“类器官活库”的建立提供技术支撑。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种原代细胞和类器官冻存液及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种无血清细胞冻存液，包括：细胞基础培养基、烟酰胺、n-乙酰半胱酰胺、b27、两性霉素、庆大霉素、dmso、rock抑制剂y27632。

3、优选的是，所述rock抑制剂y27632的含量为2-10μm。

4、优选的是，所述的无血清细胞冻存液还包括白蛋白bsa；

5、优选的是，白蛋白bsa的含量为1-3wt％。

6、优选的是，所述的无血清细胞冻存液还包括葡聚糖。

7、优选的是，葡聚糖的含量为1-5mg/ml。

8、优选的是，所述细胞基础培养基为advanced dmem/f12。

9、优选的是，所述的无血清细胞冻存液包括：advanced dmem/f12、烟酰胺5-20mm、n-乙酰半胱酰胺0.5-2mm、1×b27、两性霉素0.125-0.5μg/ml、庆大霉素5-20μg/ml、dmso 5-20wt％、rock抑制剂y27632 2-10μm、白蛋白bsa 1-3wt％、葡聚糖1-5mg/ml。

10、优选的是，所述的无血清细胞冻存液包括：advanced dmem/f12、烟酰胺10mm、n-乙酰半胱酰胺1mm、1×b27、两性霉素0.25μg/ml、庆大霉素10μg/ml、dmso 10wt％、rock抑制剂y27632 10μm、白蛋白bsa3wt％、葡聚糖5mg/ml。

11、本发明还提供一种如上所述的无血清细胞冻存液的应用，其用于原代细胞和类器官的冻存。

12、本发明的有益效果是：

13、本发明提供的冻存液可用于冻存多种原代细胞、人正常组织和肿瘤组织类器官，以及小鼠正常组织类器官，采用该冻存液保存原代细胞和类器官，能高效维持类器官中的细胞干性，维持细胞和类器官的活性，具有较高的复苏培养成功率。

技术特征：

1.一种无血清细胞冻存液，其特征在于，包括：细胞基础培养基、烟酰胺、n-乙酰半胱酰胺、b27、两性霉素、庆大霉素、dmso、rock抑制剂y27632。

2.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述rock抑制剂y27632的含量为2-10μm。

3.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，还包括白蛋白bsa。

4.根据权利要求3所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述白蛋白bsa的含量为1-3wt％。

5.根据权利要求4所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，还包括葡聚糖。

6.根据权利要求5所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述葡聚糖的含量为1-5mg/ml。

7.根据权利要求6所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，所述细胞基础培养基为advanced dmem/f12。

8.根据权利要求7所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，包括：advanced dmem/f12、烟酰胺5-20mm、n-乙酰半胱酰胺0.5-2mm、1×b27、两性霉素0.125-0.5μg/ml、庆大霉素5-20μg/ml、dmso 5-20wt％、rock抑制剂y276322-10μm、白蛋白bsa 1-3wt％、葡聚糖1-5mg/ml。

9.根据权利要求8所述的无血清细胞冻存液，其特征在于，包括：advanced dmem/f12、烟酰胺10mm、n-乙酰半胱酰胺1mm、1×b27、两性霉素0.25μg/ml、庆大霉素10μg/ml、dmso10wt％、rock抑制剂y27632 10μm、白蛋白bsa 3wt％、葡聚糖5mg/ml。

10.一种如权利要求1-9中任意一项所述的无血清细胞冻存液的应用，其用于原代细胞和类器官的冻存。

技术总结
本发明公开了一种无血清细胞冻存液及其应用，该冻存液包括：Advanced DMEM/F12、烟酰胺5‑20mM、N‑乙酰半胱酰胺0.5‑2mM、1×B27、两性霉素0.125‑0.5μg/mL、庆大霉素5‑20μg/mL、DMSO 5‑20wt％、Rock抑制剂Y276322‑10μM、白蛋白BSA1‑3wt％、葡聚糖1‑5mg/mL。本发明提供的冻存液可用于冻存多种原代细胞、人正常组织和肿瘤组织类器官，以及小鼠正常组织类器官，采用该冻存液保存细胞和类器官，能高效维持细胞和类器官中的细胞干性，维持细胞的活性，具有较高的复苏培养成功率。

技术研发人员：董文飞,张丽星,葛明锋,闫海洋
受保护的技术使用者：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25