猪精液冷冻保存添加剂及冷冻保存剂

本发明属于猪精液冷冻保存，尤其涉及一种猪精液冷冻保存剂及应用方法。

背景技术：

1、蛋白质组学在宏观角度认识精子蛋白质的组成、分布和基于表型分析挖掘精子冷冻耐受能力的关键因素。精子生物功能的发挥和调控主要通过蛋白质的翻译后修饰实现。精子从睾丸射出之后，蛋白质的合成能力基本丧失，蛋白质组学将阐明不同个体公猪精液对冷冻耐受性的差异。

2、猪冷冻精液技术是指从公猪体内采集到的原精经过特殊处理之后，保存在-196℃的液氮中，抑制精子的生理代谢活动，从而达到长期储存的目的。在非洲猪瘟肆虐情况下，冷冻精液有着便于储存、运输、扩大优质种畜使用范围等优点。

3、但精子在降温过程中会受到冷冻损害，导致精子的品质不高，受胎率低等效果。现有的技术中对于提高猪精液冷冻保存后精子质量往往采用控制冷藏、冷冻条件、添加抗冷冻保存剂或二者相结合的方式。在抗冷冻保存剂的研究中，除了常规的甘油、氨基酸、糖类、缓冲剂等，多是对猪精子具有额外保护作用的添加剂的研究，但大多数能产生较佳有益效果的添加剂，往往产量较小或价格昂贵，或者需要一定的制取过程。在应用于猪精液保存上性价比并不高，实用性欠缺。

4、故提供一种容易获取、价格低廉、能产生优异保护作用的猪精液冷冻添加剂，以减少精子在冷冻过程中受到的理化损伤、提高冷冻后精子活性是非常有必要的。

技术实现思路

1、针对现有技术中对猪精子具有额外保护作用的添加剂应用于猪精液保存上性价比不高的技术问题，本发明提供一种猪精液冷冻保存剂及应用方法。

2、本发明提供的技术方案如下：一种猪精液冷冻保存剂，包括α-淀粉酶，所述α-淀粉酶的含量为10-1000μg/l。

3、进一步地，所述猪精液冷冻保存剂包括冷藏液和冷冻液；所述冷藏液包括：灭菌蒸馏水、乳糖、卵黄、脯氨酸、α-淀粉酶；所述冷冻液包括：冷藏液(不含α-淀粉酶)、甘油、equex.stm抗冻剂、脯氨酸、α-淀粉酶。

4、进一步地，所述冷藏液中除α-淀粉酶各组分质量比为：160:17-18:29-39:0.225-0.235；α-淀粉酶添加量为10～1000μg/ml。

5、进一步地，所述冷冻液中除α-淀粉酶各组分质量比为：92.5:5-7:29-39:0.225-0.235；α-淀粉酶添加量为10～1000μg/ml。

6、优选的，α-淀粉酶添加量为1000μg/ml。

7、进一步地，所述冷藏液的制备过程如下：按比例称取相应质量的乳糖加入灭菌蒸馏水中，加入卵黄，充分混匀后，以2800转/min离心30min；取上清液，在其中加入脯氨酸，再添加α-淀粉酶。

8、本发明还提供上述猪精液冷冻保存剂的应用方法，包括如下步骤：

9、s1、将完成采集、预处理后的公猪精液加入离心瓶中，对猪精液进行离心处理，离心后去除上清液；

10、s2、在去除上清液后的猪精子中加入冷藏液，使精子重新悬浮后放入4℃冰箱中，静置3～4h；

11、s3、在冷藏静置后的精液中加入冷冻液，使之达到有效目标精子浓度后充分混匀；在4℃环境中，通过灌装机将精液吸入细管中，后将装有精液的细管批量均匀平铺在冷冻架中，放在液氮液面上预冷；随后放入液氮中冷冻。

12、进一步地，步骤s1中还包括：记录离心瓶质量为m1，去除上清液后称取离心瓶和精子总重为m2，估算的精子质量m3＝m2-m1；

13、步骤s2中加入冷藏液的体积v1(ml)＝总精子数(亿)/[目标(亿/ml)*3]-m3；

14、步骤s3中加入冷冻液的体积v2(ml)＝1/2v1(ml)。

15、进一步地，步骤s1中公猪精液采集、预处理过程包括：

16、s11、采集精液：猪精液的采集选取射精中段的精液75～125ml；

17、s12、原精液检测：原精呈为灰白色或乳白色，使用显微镜检测采集鲜精液的活力密度，选取精子活力≥90％，精子密度≥2亿/ml的猪精液；

18、s13、精液预稀释：对采集后公猪精液加入1～2倍体积bts稀释剂，在等温32～35℃下，缓慢加入原精中，轻轻摇匀；稀释完毕后，用棉花包裹放置于17℃的恒温箱中。

19、进一步地，猪精液冷冻保存剂的应用方法还包括步骤s4精液解冻：将冷冻后的细管在50℃解冻16s，剪去细管两端，将精液移入在30℃预热的离心管中孵育1min。

20、本发明的优势在于：本发明的冷冻保存剂整体组分简洁、成本低廉，整体性价比较高；由于α-淀粉酶的在冷冻保存剂中的加入，能对猪冷冻精液的保存质量有显著提高；有效的提高猪冷冻精液活力、顶体完整性、dna完整性、线粒体活性多项理化性质。

技术特征：

1.一种猪精液冷冻保存剂，其特征在于，包括α-淀粉酶，所述α-淀粉酶的含量为10-1000μg/l。

2.根据权利要求1所述的猪精液冷冻保存剂，其特征在于，所述猪精液冷冻保存剂包括冷藏液和冷冻液；所述冷藏液包括：灭菌蒸馏水、乳糖、卵黄、脯氨酸、α-淀粉酶；所述冷冻液包括：冷藏液(不含α-淀粉酶)、甘油、equex.stm抗冻剂、脯氨酸、α-淀粉酶。

3.根据权利要求2所述的猪精液冷冻保存剂，其特征在于，所述冷藏液中除α-淀粉酶各组分质量比为：160:17-18:29-39:0.225-0.235；α-淀粉酶添加量为10～1000μg/ml。

4.根据权利要求2所述的猪精液冷冻保存剂，其特征在于，所述冷冻液中除α-淀粉酶各组分质量比为：92.5:5-7:29-39:0.225-0.235；α-淀粉酶添加量为10～1000μg/ml。

5.根据权利要求3或4所述的猪精液冷冻保存剂，其特征在于，α-淀粉酶添加量为1000μg/ml。

6.根据权利要求2所述的猪精液冷冻保存剂，其特征在于，所述冷藏液的制备过程如下：按比例称取相应质量的乳糖加入灭菌蒸馏水中，加入卵黄，充分混匀后，以2800转/min离心30min；取上清液，在其中加入脯氨酸，再添加α-淀粉酶。

7.一种猪精液冷冻保存剂的应用方法，其特征在于，用于如权利要求2-6任一所述的猪精液冷冻保存剂的应用；包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的猪精液冷冻保存剂的应用方法，其特征在于，步骤s1中还包括：记录离心瓶质量为m1，去除上清液后称取离心瓶和精子总重为m2，估算的精子质量m3＝m2-m1；

9.根据权利要求7所述的猪精液冷冻保存剂的应用方法，其特征在于，步骤s1中公猪精液采集、预处理过程包括：

10.根据权利要求7所述的猪精液冷冻保存剂的应用方法，其特征在于，还包括步骤s4、精液解冻：将冷冻后的细管在50℃解冻16s，剪去细管两端，将精液移入在30℃预热的离心管中孵育1min。

技术总结
本发明提供一种猪精液冷冻保存剂及应用方法；猪精液冷冻保存剂包括α‑淀粉酶，α‑淀粉酶的含量为10‑1000μg/L。冷冻保存剂的应用方法为：将完成采集、预处理后的公猪精液离心，离心后去除上清液；加入冷藏液，使精子重新悬浮后放入4℃冰箱中，静置3～4h；加入冷冻液充分混匀；在4℃下将精液灌装入细管中，后将细管批量均匀平铺在冷冻架中，放在液氮液面上预冷、随后放入液氮中冷冻。本发明的优势在于：冷冻保存剂整体组分简洁、成本低廉，整体性价比较高；由于α‑淀粉酶的在冷冻保存剂中的加入，能对猪冷冻精液的保存质量有显著提高；有效的提高猪冷冻精液活力、顶体完整性、DNA完整性、线粒体活性多项理化性质。

技术研发人员：王克君,杨峰,李文婷,焦行,商鹏,张松源,张力戈,程馨瑞
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11