一种缩短木薯再生植株周期的方法

本发明属于植物组织培养，涉及一种木薯培养技术，具体涉及一种缩短木薯再生植株周期的方法。

背景技术：

1、木薯(manihot esculenta crantz)是世界三大薯类(马铃薯、甘薯、木薯)之一，起源于热带美洲，广泛栽培于热带和亚热带地区，是热带湿地低收入农户近10亿人的主要粮食。木薯作为我国重要的国家战略资源，在保障国防与经济安全、发展非粮生物质能源及农民增收等方面发挥了重要作用。木薯因其适应性强，耐旱、耐贫瘠等优势而被广泛种植。木薯块根富含淀粉，高达为20-35％，除作为食粮外，在化工、医药、纺织等方面均有重要作用，是淀粉及其深加工工业和动物饲料的重要来源，也是世界公认的一种很有发展潜力的可再生能源作物，具有使用的广泛性和独特性。

2、木薯作为一种重要的热带作物，目前新品种的培育主要为传统杂交育种，但是近年来基于基因工程的定向遗传改良发展迅速。木薯基因工程育种主要依赖于脆性胚性愈伤(fec)的遗传转化，但是因fec获取周期长、品种差异大，导致木薯分子定向育种进程缓慢。

技术实现思路

1、本发明为了解决现有技术存在fec获取周期长、品种差异大，导致木薯分子定向育种进程缓慢的技术问题，提出了一种快速获得优质fec的方法使得木薯再生植株的进程缩短，为缩短木薯遗传转化，加快实现木薯遗传改良奠定了基础。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种缩短木薯再生植株周期的方法，包括以下步骤：

3、步骤s1无菌苗的获得

4、(s1-1)取田间种植的sc8或zmi93木薯嫩茎，除去叶片，把嫩茎组织用网袋装好放在烧杯中用自来水流水冲洗2-4h；

5、(s1-2)在超净工作台中，用10％次氯酸钠浸泡5-10min，再用灭菌蒸馏水清洗3次除去次氯酸钠；

6、(s1-3)用灭菌的吸水纸吸干嫩茎表面的水份，根据芽眼位置切成小段，即芽眼上端尽量去除，但不伤到芽眼，下端留有1-1.5cm插到ms培养基中，12h，28℃光照培养，扩繁40-50天，得到无菌苗，备用；

7、步骤s2 fec的诱导

8、(s2-1)将无菌苗带侧芽的茎段切下1-2cm，将切下的茎段横放于cam培养基中，28℃黑暗培养3-5天，诱导腋芽膨大；

9、(s2-2)显微镜下观察侧芽膨大情况，用注射器针头将所有膨大的腋芽用1ml注射器的针头挑出，放置于cim培养基中28℃黑暗培养18-20天；

10、(s2-3)挑取腋芽上诱导形成的膨大的体胚，去除粘性的非胚性愈伤组织，将体胚转移至ms培养基中28℃黑暗培养培养5-8天，长出球形胚和鱼雷胚；

11、(s2-4)挑出优质的体胚，分成小簇后集中放置于gd培养基中，28℃黑暗培养18-21天，期间每个隔18-21天换1-2次gd培养基，诱导其产生脆性愈伤组织，即脆性胚性愈伤fec；

12、步骤s3 fec扩繁

13、(s3-1)挑选形态为球形胚或鱼雷胚的fec至新的gd培养基中，分成小簇集中放置，置于28℃黑暗培养21天；

14、(s3-2)根据需要可以扩繁8-10代，将生长状态好的fec挑取到新的gd培养基，丢弃非胚性愈伤及生长状态不好的愈伤，循环培养2-3次后的fec即可用于后续木薯转基因实验；

15、步骤s4 fec诱导植株再生

16、将纯化过的fec放置到cem培养基中，置于28℃12h光照培养7-15天后，长出子叶，叶片形成变绿，植株开始正常生长。

17、进一步地，步骤(s1-1)中，所述自流水水流呈线性流下不断，流速为400-500ml/min，优选为500ml/min，可以保证在冲洗过程不会对嫩茎造成损伤。

18、进一步地，步骤(s2-1)中，所述cam培养基含有ms+10mg/l 6-ba。

19、进一步地，步骤(s2-2)中，所述cim培养基含有ms+1mlpicloram(12mg·ml-1)+1mlcuso4(2mm)。

20、进一步地，步骤(s2-3)中，将体胚转移至ms培养基中培养时间优选为7天，将短期的放置可以加快体胚的形成，但是不能过长时间放置，避免直接把球形胚放置到扇形胚也就是子叶的阶段。

21、进一步地，步骤(s2-3)中，如果操作过程中出现扇形胚，将扇形胚剁碎重新放置cim培养基中诱导使其获取更多地球形胚和鱼雷胚。

22、进一步地，步骤(s2-4)中，所述优质的体胚是体胚在球形胚的状态。

23、进一步地，所述步骤(s2-4)中，每组小簇含有50-80个体胚。

24、进一步地，所述gd培养基含有nh4no31.0g/l、h3bo30.3mg/l、ca(no3)2241.2mg/l、cuso40.025 mg/l、cocl20.025 mg/l、mnso41.0 mg/l、na2edta 37.25mg/l、kcl 65mg/l、feso428.85mg/l、ki 0.8mg、mgso417.099g/l、kno31.0g/l、na2moo40.025mg/l、znso40.3mg/l、kh2po40.3g/l、生物素0.2mg/l、甘氨酸4.0mg/l、肌醇0.01g/l、烟酸0.1mg/l、维生素b60.1mg/l、维生素b11.0mg/l。

25、进一步地，步骤s4中，所述cem培养基含有ms+400ml 6-ba(1mg ml-1)+1ml cuso4(2mm)。

26、进一步地，所述ms培养基配方含有mg/l大量元素：nh4no31650、kno31900、cacl2·2h2o 440、mgso4·7h2o 370、kh2po4700；微量元素：ki 0.83、h3bo36.2、mnso4·4h2o 22.3、znso4·7h2o 8.6、na2mno4·2h2o 0.25、cuso4·5h2o 0.025、cocl2·6h2o 0.025、feso4·7h2o 27.8、na2-edta·2h2o 37.3；有机成分：肌醇100、烟酸0.5、盐酸吡哆醇(维生素b6)0.5、盐酸硫胺素(维生素b1)0.5、甘氨酸2。

27、与现有技术相比，本发明缩短木薯再生植株周期的方法具有以下的有益效果：本发明采用自来水流速400-500ml/min对木薯嫩茎组织进行冲洗，优选为500ml/min，500ml/min的自流水流速不仅可以快速冲洗木薯嫩茎表皮污染物，还可以保证在冲洗过程不会对嫩茎造成损伤。经过本发明步骤(s2-3)将体胚转移至ms培养基中培养，能加快至少17-23天诱导长出大量优质球形胚和鱼雷胚。本发明创新地控制体胚在ms培养基中培养5-8天可以加快体胚的形成。

技术特征：

1.一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：步骤(s1-1)中，所述自流水水流呈线性流下不断，流速为400-500ml/min。

3.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：步骤(s2-1)中，所述cam培养基含有ms+10mg/l 6-ba。

4.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：步骤(s2-2)中，所述cim培养基含有ms+1mlpicloram(12mg·ml-1)+1ml cuso4(2mm)。

5.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：步骤(s2-3)中，将体胚转移至ms培养基中培养7天。

6.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：步骤(s2-4)中，所述优质的体胚是体胚在球形胚的状态。

7.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：所述步骤(s2-4)中，每组小簇含有50-80个体胚。

8.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：所述gd培养基含有nh4no31.0g/l、h3bo30.3mg/l、ca(no3)2241.2mg/l、cuso40.025 mg/l、cocl20.025 mg/l、mnso41.0 mg/l、na2edta37.25mg/l、kcl 65mg/l、feso428.85mg/l、ki 0.8mg、mgso417.099g/l、kno31.0g/l、na2moo40.025mg/l、znso40.3mg/l、kh2po40.3g/l、生物素0.2mg/l、甘氨酸4.0mg/l、肌醇0.01g/l、烟酸0.1mg/l、维生素b60.1mg/l、维生素b11.0mg/l。

9.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：步骤s4中，所述cem培养基含有ms+400ml 6-ba(1mg ml-1)+1ml cuso4(2mm))。

10.根据权利要求1所述的一种缩短木薯再生植株周期的方法，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种缩短木薯再生植株周期的方法，包括以下步骤：无菌苗的获得、FEC的诱导、FEC扩繁、FEC诱导植株再生；本发明采用自来水流速400‑500mL/min对木薯嫩茎组织进行冲洗，优选为500mL/min，500mL/min的自流水流速不仅可以快速冲洗木薯嫩茎表皮污染物，还可以保证在冲洗过程不会对嫩茎造成损伤。经过将体胚转移至MS培养基中培养，能加快至少17‑23天诱导长出大量优质球形胚和鱼雷胚；本发明创新地控制体胚在MS培养基中培养5‑8天可以加快体胚的形成。

技术研发人员：罗秀芹,韦卓文,罗知妃,安飞飞,薛晶晶,朱文丽,蔡杰,陈松笔
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15