一种提高甜玉米再生及转化效率的方法

本发明涉及植物基因工程，具体涉及一种提高甜玉米再生及转化效率的方法。

背景技术：

1、甜玉米因其营养丰富、口感好深受广大消费者的喜爱，作为一种新型的果蔬兼用作物，在改善居民膳食结构、出口创汇上起到不可忽视的作用。浙江省是甜玉米的种植和消费大省，对优质甜玉米品种的需求非常大。而种质资源狭窄和育种技术滞后等因素严重制约我省甜玉米产业高质量发展。

2、转基因技术作为一项新兴的生物技术，在提高作物产量、品质及抗性方面提供了一种新的技术方案。尽管现有技术已经公开了不少玉米的遗传转化方法，但不同的基因型仍然是限制玉米遗传转化效率的重要因素，甜玉米遗传转化同样受到基因型的限制。目前，适用于甜玉米遗传转化的受体非常有限，效率也非常低。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明的目的在于克服甜玉米现有遗传转化中存在再生能力差、转化效率低、转化周期长等缺陷，提供一种甜玉米再生及转化效率的方法。

2、为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、提供一种提高甜玉米再生及转化效率的方法，其包括以下步骤：

4、利用甜玉米品种雪甜7401与hiii杂交，再回交、连续自交一系列过程培育出一个再生能力强、遗传转化效率高的甜玉米基因型材料，将其用于转化。

5、进一步地，具体包括以下步骤：

6、a.利用诱导培养基对不同甜玉米品种的幼胚再生能力进行测试，测定包括愈伤的诱导效率、愈伤的增殖速度、愈伤的生长状态等，得到再生能力强的测试材料，将所得的材料入选后续的分化试验。

7、b.利用愈伤分化培养基对前期筛选的不同甜玉米品种的愈伤进行测试，测定包括愈伤的增殖速度、愈伤的分化时间和效率等，得到再生能力强的测试材料入选后续的培育试验。

8、c.对筛选出来的甜玉米品种雪甜7401同hiii进行杂交，获得的f1代，再同7401回交2次，bc2f1后代再进行自交2代，从中挑选出再生能力强的甜玉米自交系th44用于转化。

9、进一步地，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化th44，具体方法包括以下子步骤：

10、(1)挑选授粉后9-12d发育正常、籽粒饱满的玉米棒子，表面消毒后取幼胚，将幼胚浸入含有农杆菌的侵染培养基中；

11、(2)将侵染后的幼胚移至共培养基上暗培养；

12、(3)将幼胚移至不含双丙氨膦的筛选培养基上继续培养2-3周左右；

13、(4)将分化的幼胚移至添加有双丙氨膦筛选培养基上继续培养，直至长出新的愈伤；

14、(5)将新的愈伤移至分化培养基上，分化形成小芽；

15、(6)再生出来的小苗移至生根培养基上；

16、(7)等小苗顶到瓶盖，可以打开炼苗，移栽，得到转基因玉米。

17、进一步地，上述培养基中的各种培养基组分及配比如下所示：

18、侵染培养基：1/2ms+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36g/l+l-脯氨酸0.115g/l+乙酰丁香酮200mm；

19、共培养基：1/2ms+蔗糖20g/l+葡萄糖10g/l+脯氨酸0.115g/l+盐酸硫胺素0.5mg/l+agno3 20mm+2,4-d 0.5mg/l+毒莠定2.2mg/l+乙酰丁香酮200mm；

20、诱导培养基：ms+蔗糖30g/l+脯氨酸2g/l+盐酸硫氨酸0.5mg/l+agno320mm+水解酪蛋白0.3g/l+2,4-d 0.5mg/l+毒秀定2.2mg/l+特美汀200mg/l；

21、筛选培养基：ms+蔗糖30g/l+脯氨酸2g/l+盐酸硫胺素0.5mg/l+agno320mm+水解酪蛋白0.3g/l+2,4-d 0.5mg/l+毒莠定2.2mg/l+特美汀200mg/l+双丙氨膦0.5-50mg/l；

22、分化培养基：ms+蔗糖20g/l+6-ba 3.5mg/l+硫酸铜10mm+mes 0.5g/l+特美汀200mg/l；

23、生根培养基：ms+蔗糖20g/l+mes 0.5g/l+iba 0.2mg/l。

24、本发明的有益效果为：

25、本发明获得的转基因甜玉米自交系th44具有植株矮小、早花、生育期短等优点，作为甜玉米转基因受体后，获得的转基因材料可以直接作为甜玉米育种的自交系，可以大大缩短甜玉米的育种周期。另外，th44的转化效率和再生能力显著高于其他甜玉米品种，对于甜玉米的转基因技术的进一步应用推广具有重要的意义。本发明通过筛选-杂交-回交-自交纯化的模式筛选出高再生及分化能力的甜玉米自交系，对指导其他植物的遗传转化研究也有一定的意义。

技术特征：

1.一种提高甜玉米再生及转化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高甜玉米再生及转化效率的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的提高甜玉米再生及转化效率的方法，其特征在于，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化th44，具体方法包括以下子步骤：

技术总结
本发明公开了一种提高甜玉米再生及转化效率的方法。首先通过对不同的甜玉米品种再生能力进行初筛，确定甜玉米品种雪甜7401的基因型适合遗传转化，但该品种的再生能力比较弱。然后利用甜玉米品种雪甜7401与HiII杂交，再通过回交和自交等一系列过程培育出一个再生能力强、遗传转化效率高的甜玉米基因型材料，申请人将这个基因型材料命名为TH44。该基因型材料TH44与其原始亲本雪甜7401相比较，其愈伤再生及转化效率均提高了2倍。利用TH44为转化受体，已将带有GFP的载体导入这个受体材料，并获得部分转基因T<subgt;0</subgt;代植株。

技术研发人员：方瑞秋,王斌,陈晓龙
受保护的技术使用者：浙江省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5