一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液

本发明属于动物繁殖，涉及了一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液。

背景技术：

1、精液冷冻效果除了与稀释液组成、稀释比例、降温处理和冷冻程序等有关外，解冻过程同样与精液冷冻效果密切相关。精液在冷冻和解冻过程中可能存在冰晶机械损伤，冰晶主要在危险温区形成(0～-60℃)，该温度区间也被称为精子死亡温度区间。如果在冷冻和解冻过程中，通过该温度区间的降温速率和升温速率过慢，便容易产生冰晶，对精子细胞产生不可逆的损伤。然而，目前，研究人员主要集中在精液冷冻过程开展一系列研究，关于绵羊精液解冻温度和时间的研究相对缺乏。

2、因此，本发明旨在通过检测精子活率、活力、运动性能、功能完整性探究解冻温度和时间对湖羊精液冷冻保存效果的影响，为湖羊精液冷冻保存技术提供一定的科学依据，为湖羊种质资源保护以及推广利用奠定基础。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明目的是提出了一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液。本发明提供的稀释液和降温方法可以大幅度提高湖羊精液冷冻保存效果以及解冻后的精子活力、质膜完整率和顶体完整性，为人工授精技术的开展奠定基础。

2、本发明的技术方案是：本发明所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其操作步骤如下：

3、(1)：将采集的湖羊精液与预备的冷冻ⅰ液按比例等温混合并进行冷藏降温；将冷藏降温后的湖羊精液与预备的冷冻ⅱ液按比例进行混合且再次冷藏平衡；

4、(2)：将第二次冷藏结束后得到的湖羊精液灌装到预备的细管中并封口，将封口后的细管进行液氮熏蒸降温并在液氮中冷冻保存；

5、(3)：后将液氮中冷冻的细管投入至设置有特定温度的水浴锅中在特定时间下持续晃动进行解冻，时间结束后从水浴锅中取出细管并擦干其表面残留的水，待用；

6、(4)：另外预备含有冷冻基础稀释液的离心管并进行预热，将待用的、表面残留水擦干的细管剪开，将细管中的湖羊精液释放至离心管中进行一定时间的孵育，最终得到解冻后的湖羊精液。

7、进一步的，在步骤(1)中，所述冷冻ⅰ液包括70～90％的冷冻基础稀释液和10～30％的卵黄，所述湖羊精液与冷冻ⅰ液的混合比例为1：2～1：4；

8、所述冷冻ⅱ液包括90％～95％的冷冻ⅰ液和5％～10％的甘油，所述冷藏后的湖羊精液与冷冻ⅱ液的混合比例为1：1～1：3。

9、进一步的，在步骤(1)中，所述两次进行冷藏的温度均为2～8℃，冷藏的时间均为2～3h。

10、进一步的，在步骤(2)中，所述细管的规格约为0.25ml，采用封口粉进行封口。

11、进一步的，在步骤(2)中，所述熏蒸降温时细管距离液氮面的距离为1～3cm，熏蒸时间为10～30min。

12、进一步的，在步骤(3)中，所述水浴锅设定的温度为37～75℃，其晃动的时间为3～30s。

13、进一步的，在步骤(4)中，所述冷冻基础稀释液的配制中包括30～40mg/ml的tris、10～20mg/ml的柠檬酸及1～10mg/ml的葡萄糖。

14、进一步的，在步骤(4)中，所述离心管进行预热的温度为30～40℃，孵育的时间为1～5min；优选的，预热温度为37℃，孵育时间为3min。

15、进一步的，所述种湖羊精液冷冻稀释液包括冷冻基础稀释液、冷冻ⅰ液和冷冻ⅱ液；所述的冷冻基础稀释液的配制优选为：包含36.4mg/ml的tris、18.2mg/ml的柠檬酸和5mg/ml的葡萄糖；

16、所述冷冻ⅰ液的配制优选为：包含80％的冷冻基础稀释液和20％的卵黄；

17、所述冷冻ⅱ液的配制优选为：包含94％的冷冻ⅰ液和6％的甘油。

18、进一步的，所述湖羊精液与冷冻ⅰ液的混合比例为1：3；所述湖羊精液两次冷藏的温度均为4℃，时间均为2.5h；

19、冷藏后的与湖羊精液冷冻ⅱ液的混合比例为1：2；熏蒸降温中距离液氮面的距离为2cm，熏蒸时间为20min。

20、本发明中包含的湖羊精液解冻温度包含有37、45、55、65、70、75℃，解冻时间包含有3～30s；优选的，所述湖羊精液解冻温度和时间包含有37℃(30s)、45℃(10s、20s、30s)、55℃(5s、8s、11s)、65℃(3s、5s、8s、11s)、70℃(3s、5s、8s、11s)、75℃(3s、5s、8s)，其中，各温度下的最优解冻时间为37℃30s、45℃20s、55℃8s、65℃5s、70℃5s、75℃3s，且其中综合比较55℃8s为湖羊精液解冻的最优方法。

21、本发明提供了一种湖羊精液冷冻保存稀释液和冷冻解冻方法。

22、本发明的有益效果是：通过本发明中的稀释液以及冷冻方法进行处理和解冻。精液的冷冻和解冻过程同等重要，都能够决定解冻后的精子活力，直接影响解冻后的精液质量。在0～-60℃的危险温度区间内，精子内外的水分子会重新排列形成冰晶，并且体积不断变大。冰晶的移动会刺破细胞膜，损伤细胞器以及染色体结构并导致细胞破裂，造成精子活力的降低。因此，控制合适的降温速率和升温速率使其快速通过该危险温度区间，是能减少大冰晶形成的有效方式。所以，针对解冻后的精子，检测其精子活率、活力、运动性能、质膜完整性和顶体完整性等，解析湖羊精子最适宜的解冻温度和时间，明确该稀释液与该解冻方法是否能提高精液冷冻保存效果和解冻后的精子活力。本发明得到的55℃解冻8s的处理能够得到较好的解冻精液质量，其精子活力、质膜和顶体完整率显著高于其它解冻温度和时间。

技术特征：

1.一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，其操作步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(1)中，所述冷冻ⅰ液包括70～90％的冷冻基础稀释液和10～30％的卵黄。

3.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(1)中，所述冷冻ⅱ液包括90％～95％的冷冻ⅰ液和5％～10％的甘油。

4.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(1)中，所述湖羊精液与冷冻ⅰ液的混合比例为1：2～1：4；

5.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(1)中，所述两次进行冷藏的温度均为2～8℃，冷藏的时间均为2～3h。

6.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(2)中，所述细管的规格为0.25ml，采用封口粉进行封口。

7.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(2)中，所述熏蒸降温时细管距离液氮面的距离为1～3cm，熏蒸时间为10～30min。

8.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(3)中，所述水浴锅设定的温度为37～75℃，其晃动的时间为3～30s。

9.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(4)中，所述冷冻基础稀释液的配制中包括30～40mg/ml的tris、10～20mg/ml的柠檬酸及1～10mg/ml的葡萄糖。

10.根据权利要求1所述的一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液，其特征在于，在步骤(4)中，所述离心管进行预热的温度为30～40℃，孵育的时间为1～5min。

技术总结
本发明公开了一种湖羊精液冷冻解冻方法及其稀释液；属于动物繁殖领域，所述湖羊精液冷冻稀释液包括冷冻基础稀释液、冷冻Ⅰ液和冷冻Ⅱ液；冷冻基础稀释液包括Tris、柠檬酸及葡萄糖；冷冻Ⅰ液包括冷冻基础稀释液和卵黄；冷冻Ⅱ液包括冷冻Ⅰ液和甘油；其操作步骤：将湖羊精液与冷冻Ⅰ液冷藏后再与冷冻Ⅱ液二次冷藏；将冷藏的湖羊精液灌装到细管中封口、液氮熏蒸；将细管投入至水浴锅中晃动解冻后剪开；将含有冷冻基础稀释液的离心管预热，将湖羊精液释放至离心管中进行孵育，得到解冻后的湖羊精液。本发明提供的湖羊精液冷冻稀释液和解冻方法显著提高了解冻后的精子活率、活力、质膜完整性以及顶体完整性，有利于湖羊精液的冷冻保存以及种质资源保护。

技术研发人员：李拥军,张柳明,江才雨,王旭洋,孙宇轩,孙晓梅
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/6/13