一种斑马鱼白细胞降低模型的构建方法及应用与流程

本发明涉及动物模型构建，尤其是涉及一种斑马鱼白细胞降低模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、目前使用的化疗药及放疗措施都是针对人体内生长繁殖旺盛的部位，而造血机能及肿瘤均属此范畴，所以放化疗杀死了癌细胞的同时也破坏了造血机能。白细胞降低后表现为免疫力降低、易疲劳、抵抗力差、容易感冒感染炎症。

2、目前使用的化学性升白药，如鲨肝醇、腺嘌呤、叶酸等都有副作用；临床上还可通过采用给予各种生长因子，以增加造血细胞的增殖。如生白能(rhgm-gsf)、惠尔血(rhg-csf)等，用来升高白细胞效果显著，但因价格昂贵，并非多数病人能够承受，并且rhgm-gsf、rhg-csf不可以在化疗的同时使用，也不可以预防使用，只能在出现白细胞减少时给予使用，否则会有毒副作用产生。因此，升白药的筛选仍是目前药物研发领域的重要内容。

3、现有技术中的白细胞减少症小鼠模型由于造模周期长，小鼠对药物不敏感需长时间给药导致实验周期长且用药量大导致无法实现高通量筛选，满足药物研发的需求。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种斑马鱼白细胞降低模型的构建方法，以至少解决现有技术中动物模型造模周期长，无法实现高通量筛选的技术问题之一。

2、本发明的目的之二在于提供一种上述的方法构建的斑马鱼白细胞降低模型在筛选治疗白细胞降低药物中的应用。

3、本发明的目的之三在于提供一种治疗白细胞降低药物的筛选方法。

4、本发明的目的之四在于提供一种应用于斑马鱼白细胞降低模型的血液细胞计数方法。

5、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

6、第一方面，本发明提供了一种斑马鱼白细胞降低模型的构建方法，包括对成年斑马鱼腹腔注射依托泊苷溶液构建斑马鱼白细胞降低模型。

7、进一步的，依托泊苷溶液的浓度为10～20μg/μl，优选为20μg/μl。

8、进一步的，所述腹腔注射依托泊苷溶液的次数为至少1次。

9、第二方面，本发明提供了上述的方法构建的斑马鱼白细胞降低模型在筛选治疗白细胞降低药物中的应用。

10、第三方面，本发明提供了一种治疗白细胞降低药物的筛选方法，使用上述的方法构建的斑马鱼白细胞降低模型筛选治疗白细胞降低药物。

11、进一步的，包括以下步骤：

12、a、将待筛选治疗白细胞降低药物施用于斑马鱼白细胞降低模型；

13、b、检测斑马鱼血液中的白细胞数量。

14、进一步的，所述将待筛选治疗白细胞降低药物施用于斑马鱼白细胞降低模型包括将斑马鱼白细胞降低模型分为对照组和给药组，所述给药组施用待筛选治疗白细胞降低药物，所述对照组施用生理盐水；

15、优选的，所述施用的方式包括浸泡或注射，优选为浸泡；

16、优选的，当所述腹腔注射依托泊苷溶液的次数大于1次时，检测斑马鱼血液中的白细胞数量的时间与最后一次待筛选治疗白细胞降低药物施用于斑马鱼白细胞降低模型的时间间隔至少3天。

17、进一步的，所述检测斑马鱼血液中的白细胞数量的方法包括血细胞计数法；

18、优选的，所述血细胞计数法包括使用改良牛鲍氏血细胞计数板对血液稀释液进行白细胞计数；

19、优选的，所述血液稀释液的制备方法为使用生理盐水稀释血液；

20、优选的，所述血液的稀释倍数为100～1000倍，优选为200倍。

21、进一步的，所述检测斑马鱼血液中的白细胞数量的方法还包括基因检测法；

22、优选的，所述基因检测法包括检测cd45的表达量和/或mpx的表达量；

23、优选的，所述检测mpx的表达量的试剂包括用于扩增mpx的引物；

24、优选的，所述用于扩增mpx的引物的核苷酸序列如seq id no:1～seq id no:2所示；

25、优选的，所述检测cd45的表达量的试剂包括用于扩增cd45的引物；

26、优选的，所述用于扩增cd45的引物的核苷酸序列如seq id no:3～seq id no:4所示；

27、优选的，所述扩增的条件包括逆转录，50℃、5min；预变性，95℃、30s；循环反应，先95℃、10s，然后55℃、30s，40个循环；溶解曲线，先95℃、15s，然后60℃、60s，最后95℃、15s。

28、第四方面，本发明提供了一种应用于上述的方法构建的斑马鱼白细胞降低模型的血液细胞计数方法，包括对稀释后的血液进行细胞计数；

29、优选的，所述血液的稀释方法包括使用生理盐水稀释血液至100～1000倍，优选为200倍。本发明提供的一种斑马鱼白细胞降低模型的构建方法，通过使用依托泊苷溶液能够使斑马鱼白细胞数量显著降低；相对于小鼠模型，造模方法简单，周期短，适合高通量筛选；选用成年斑马鱼，可采集血液进行检测，实现全方位评估药物药效。

技术特征：

1.一种斑马鱼白细胞降低模型的构建方法，其特征在于，包括对成年斑马鱼腹腔注射依托泊苷溶液构建斑马鱼白细胞降低模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，依托泊苷溶液的浓度为10～20μg/μl，优选为20μg/μl。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腹腔注射依托泊苷溶液的次数为至少1次。

4.权利要求1～3任一项所述的方法构建的斑马鱼白细胞降低模型在筛选治疗白细胞降低药物中的应用。

5.一种治疗白细胞降低药物的筛选方法，其特征在于，使用权利要求1～4任一项所述的方法构建的斑马鱼白细胞降低模型筛选治疗白细胞降低药物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述将待筛选治疗白细胞降低药物施用于斑马鱼白细胞降低模型包括将斑马鱼白细胞降低模型分为对照组和给药组，所述给药组施用待筛选治疗白细胞降低药物，所述对照组施用生理盐水；

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测斑马鱼血液中的白细胞数量的方法包括血细胞计数法；

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测斑马鱼血液中的白细胞数量的方法还包括基因检测法；

10.一种应用于权利要求1～3任一项所述的方法构建的斑马鱼白细胞降低模型的血液细胞计数方法，其特征在于，包括对稀释后的血液进行细胞计数；

技术总结
本发明提供了一种斑马鱼白细胞降低模型的构建方法及应用，涉及动物模型构建技术领域，包括对成年斑马鱼腹腔注射依托泊苷溶液构建斑马鱼白细胞降低模型，通过使用依托泊苷溶液能够使斑马鱼白细胞数量显著降低；相对于小鼠模型，造模方法简单，周期短，适合高通量筛选；选用成年斑马鱼，可采集血液进行检测，实现全方位评估药物药效。

技术研发人员：卓频
受保护的技术使用者：倍科为（天津）生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/1